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Jun 04, 2023

Eine Punktmutation in recC, die mit dem subklonalen Ersatz von Carbapenem verbunden ist

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2464 (2023) Diesen Artikel zitieren 2206 Zugriffe auf 2 Altmetric Metrics-Details Die Anpassung an selektiven Druck ist für klinisch wichtige Krankheitserreger von entscheidender Bedeutung

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2464 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Anpassung an selektive Zwänge ist für klinisch wichtige Krankheitserreger von entscheidender Bedeutung, um Epidemien auszulösen. Die zugrunde liegenden evolutionären Triebkräfte sind jedoch noch wenig verstanden. Die aktuelle Epidemie Carbapenem-resistenter Klebsiella pneumoniae (CRKP) stellt eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. In dieser Studie analysierten wir die Genomsequenzen von 794 CRKP-Blutisolaten, die zwischen 2014 und 2019 in 40 Krankenhäusern in China gesammelt wurden. Wir entdeckten einen subklonalen Ersatz im vorherrschenden Klon ST11, wobei der zuvor vorherrschende Subklon OL101:KL47 durch O2v1:KL64 ersetzt wurde Zeit schrittweise. O2v1:KL64 trug eine höhere Ladung mobiler genetischer Elemente und eine Punktmutation, die ausschließlich im recC von O2v1:KL64 nachgewiesen wurde, fördert die Rekombinationsfähigkeit erheblich. Der epidemische Erfolg von O2v1:KL64 war außerdem mit einer hypervirulenten Sublinie mit erhöhter Resistenz gegen Phagozytose, Sulfamethoxazol-Trimethoprim und Tetracyclin verbunden. Die phänotypischen Veränderungen standen im Zusammenhang mit der Überrepräsentation von Hypervirulenzdeterminanten und Antibiotikagenen, die durch den Erwerb eines rmpA-positiven pLVPK-ähnlichen Virulenzplasmids bzw. eines multiresistenten Plasmids vom IncFII-Typ verursacht wurden. Die Verbreitung der Unterlinie wurde durch häufigere Übertragungen zwischen Krankenhäusern weiter gefördert. Die Ergebnisse zeigen insgesamt, dass die Expansion von O2v1:KL64 mit einem Repertoire genomischer Veränderungen korreliert, die in einer Subpopulation mit evolutionären Vorteilen konvergieren.

Klebsiella pneumoniae ist weltweit ein bedeutender nosokomialer Krankheitserreger, und seine bemerkenswerte Fähigkeit, Antibiotikaresistenzen zu entwickeln, erleichtert weitgehend seine weite Verbreitung. Im letzten Jahrzehnt ist die Rate multiresistenter (MDR) K. pneumoniae, insbesondere Carbapenem-resistenter K. pneumoniae (CRKP), weltweit im Aufwärtstrend und geht mit einer enormen globalen Belastung für die öffentliche Gesundheit einher1,2,3. Insbesondere durch CRKP verursachte Blutkreislaufinfektionen (BSI) stellen eine große Herausforderung für die klinische Behandlung dar und führen zu einer hohen Sterblichkeitsrate von bis zu über 50 % im nosokomialen Umfeld4,5. Die Weltgesundheitsorganisation hat CRKP in eine Liste antimikrobiell resistenter prioritärer Krankheitserreger aufgenommen, für die dringend neue Antibiotika benötigt werden.

Die rasche Ausbreitung von CRKP wurde auf den Erwerb von Carbapenemasen sowie auf die Etablierung erfolgreicher Klone (dh Hochrisikoklone) zurückgeführt. Die Bevölkerungsstruktur von CRKP variiert geografisch6. In Asien, insbesondere China, ist der KPC-2-produzierende Sequenztyp (ST) 11 vorherrschend und macht bis zu 60–70 % von CRKP3 aus. ST258, ein angeblicher Nachkomme von ST11, ist zum am weitesten verbreiteten KPC-2/KPC-3-produzierenden Klon in Nordamerika, Lateinamerika und Europa geworden2,6,7. Obwohl diese Klone in bestimmten Regionen seit Jahrzehnten eine hohe Prävalenz aufweisen, wurden intraklonale Segregationen beobachtet. In der ST11- und ST258-Population wurden mehr als zwei Subklone identifiziert, und Rekombinationen, an denen der Kapsel-Polysaccharid-Synthese-Locus (CPS) beteiligt ist, sollen in erster Linie für die genetische Diversifizierung verantwortlich sein4,8,9. Wir haben kürzlich einen subklonalen Wechsel zwischen CRKP-ST11-Blutisolaten entdeckt, die zwischen 2013 und 2017 in einem einzigen Zentrum in China gesammelt wurden, wobei ST11-KL47 durch ST11-KL64 als vorherrschender Subklon verdrängt wurde4. Noch besorgniserregender ist, dass ST11-KL64 eine erhöhte Pathogenität entwickelt hat, was im Vergleich zu ST11-KL47 zu einer deutlich höheren 30-Tage-Mortalität führt. Die raumzeitliche Dynamik und die zugrunde liegenden Triebkräfte der Bevölkerungsstruktur sind jedoch nach wie vor kaum verstanden.

In dieser Arbeit untersuchen wir die genomische Entwicklung von 794 CRKP-Isolaten, die im Rahmen der nationalen Überwachung von Blutisolaten zwischen 2014 und 2019 in ganz China gesammelt wurden, um die räumliche und zeitliche dynamische Populationsstruktur von CRKP-ST11 aufzuklären und die genetischen und phänotypischen Treiber zu analysieren der intraklonalen Diversifikation. Die genomischen Veränderungen, die mit subklonalen Schaltern und phänotypischen Variationen in der dominanten ST11-Population korrelieren, werden charakterisiert und mit evolutionären Treibern verknüpft.

Zwischen 2014 und 2019 wurden 4635 komplexe Blutstromisolate der Spezies K. pneumoniae in 45 Sentinel-Krankenhäusern in 19 Provinzen gesammelt, die 75,7 % der Bevölkerung Chinas (ca. 1,06 Milliarden) abdecken (Abb. 1a). Insgesamt wurden 794 nicht repetitive CRKP-Isolate in 40 Krankenhäusern in 16 Provinzen identifiziert, darunter 772 K. pneumoniae sensu stricto, 10 K. variicola, 11 K. quasipneumoniae und 1 K. michiganensis (gehört nicht zum K. pneumoniae-Artenkomplex). wurde aber in die Analyse einbezogen) (Ergänzende Abbildung 1 und ergänzender Datensatz 1). Der CRKP-Anteil war im Untersuchungszeitraum von 11,2 % auf 17,7 % gestiegen (Abb. 1b). Die Populationsstruktur von CRKP-BS war sehr komplex und es wurden 72 STs nachgewiesen (Ergänzungsdatensatz 1). ST11 war der vorherrschende Klon (81,4 %; 646/794), gefolgt von ST15 (55/794; 6,93 %).

a Geografische Verteilung der 45 an dieser Studie teilnehmenden Sentinel-Krankenhäuser. Die Anzahl der in jeder Provinz gesammelten Isolate wird rechts durch Farbverläufe angezeigt. b Die Grafik zeigt die Anzahl (dunkelrote Balken) und das Verhältnis der CRKP (rote Linie), die jedes Jahr während der Überwachung festgestellt wurden. c Die Grafik zeigt die Anzahl der jedes Jahr in CRKP entdeckten O2v1:KL64 und OL101:KL47 (blaue Balken) sowie das Verhältnis von O2v1:KL64 zu CRKP-ST11 (violette Linie) und OL101:KL47 zu CRKP-ST11 (blaue Linie). ). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Ein oder mehrere Carbapenemase-Gene wurden in 771 von 794 Isolaten (97,1 %) nachgewiesen, und 753 gehörten zu K. pneumoniae sensu stricto, das für blaKPC-ähnliches (n = 712; einschließlich 709 blaKPC-2 und 3 blaKPC-3) blaNDM kodierte -ähnliche (n = 36), blaIMP-ähnliche (n = 4) und blaOXA-48-ähnliche (n = 5) Gene (Ergänzungsdatensatz 1). Die Mehrheit der blaKPC-ähnlichen positiven K. pneumoniae sensu stricto-Isolate (686/712; 96,3 %) gehören zu ST11 und ST15, was auf eine klonale Verbreitung von blaKPC-ähnlichen Genen in China hindeutet.

Wir identifizierten 55 K-Loci (KLs, Kapselsyntheseorte) und zehn O-Loci (OLs, äußere Lipopolysaccharidsyntheseorte) in der CRKP-BS-Population (Ergänzungsdatensatz 1). ST11 umfasste 13 KLs und 8 OLs, von denen KL64 (422/646; 65,3 %) und O2v1 (418/646; 64,8 %) am häufigsten vorkamen, gefolgt von KL47 (192/646; 29,7 %) und OL101 (ein O12). Derivat) (193/646; 29,9 %). ST15 umfasste 5 KLs und 5 OLs, und KL19 (43/56; 76,8 %) und O2v1 (42/56; 75 %) waren vorherrschend. Der Anteil von OL101:KL47 unter CRKP-ST11 sank von 78,1 % (25/32) im Jahr 2014 auf 9,7 % (22/226) im Jahr 2019, während der von O2v1:KL64 (4 OL102:KL64-Isolate wurden zur Vereinfachung der Analyse einbezogen). durch die Studie) stieg von 15,6 % (5/32) im Jahr 2014 auf 81,4 % (184/226) im Jahr 2019 (Abb. 1c). Die Ergebnisse zeigen, dass innerhalb der ST11-Population in China ein subklonaler Austausch von OL101:KL47 zu O2v1:KL64 stattgefunden hat. Der Subklon O2v1:KL19 war während des Untersuchungszeitraums konstant in ST15 vorherrschend (66,7 %–87 %).

Um die phylogenetische Verwandtschaft dieser ST11-Subklone zu bestimmen, wurde ein Maximum-Likelihood-Baum aus 4460 rekombinationsfreien SNPs abgeleitet. Eine Gruppe bestehend aus den Isolaten O2v1:KL103, O2v2:KL105, O3b:KL111 und O4:KL15 war basal im Baum (Abb. 2) und stellte die angestammte Gruppe der ST11-Isolate dar. Alle O2v1:KL64-Isolate gruppierten sich, um die am tiefsten verzweigte Gruppe zu bilden, und gruppierten sich auch mit einer Unterlinie von OL101:KL47, was darauf hindeutet, dass O2v1:KL64 von OL101:KL47 abgeleitet wurde. Dies steht im Einklang mit unserer vorherigen Schlussfolgerung aus Single-Center-Daten4. Die anderen Serotypen gruppierten sich entweder mit OL101:KL47 (O3/O3a:KL10 und O5:KL25) oder mit O2v1:KL64 (O2v1:KL21, O2v1:KL28, O2v1:KL31, O2v1:KL103, O2v1:KL107 und O3/O3a). :KL58), was die Annahme stützt, dass sie sich aus den beiden Hauptunterklonen entwickelt haben.

Der phylogenetische Baum wurde erhalten, indem alle Sequenzablesungen auf die Hybridanordnung eines ST11-OL101:KL47-Isolats (KP16932) abgebildet und die rekombinierten Regionen aus dem Alignment entfernt wurden. Der Baum wurde mit den ST258-Außengruppenisolaten (graues Dreieck) bewurzelt. In unserer ST11-Sammlung wurden dreizehn O/K-Kombinationen erkannt, die in unterschiedlichen Farben angezeigt werden, wie in der Legende dargestellt. Die erkannten Hypervirulenz-Biomarker (mit Ausnahme von Iro aufgrund seiner Seltenheit in unserer Sammlung) werden hier angezeigt. Dargestellt sind die ARGs [blaLAP-2, dfrA-like, qnr-like, sul-like, tet(A) und oqxAB], die mit deutlich unterschiedlicher Häufigkeit zwischen OL101:K47 und O2v1:KL64 nachgewiesen wurden. Die Replikontypen, die der vorherrschenden Virulenz [IncHI1B(pNDM-MAR) und IncFIB(Kpn3)] und dem MDR-Plasmid [IncFII(pCRY)] entsprechen, das diese ARGs trägt (außer oqxAB), werden hier gezeigt. Das RecC-Allel (RecCHis935Arg) wurde ausschließlich in O2v1:KL64 nachgewiesen, wie auf dem Zweig gezeigt, und die im Rekombinationstest verwendete Referenz (KP37485) ist auf dem Baum angegeben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir identifizierten 42.824 Kerngenom-SNPs vor und 4460 SNPs nach der Entfernung von Rekombinationsregionen, was darauf hindeutet, dass die Rekombination stark zur Populationsvielfalt beigetragen hat. Dazu gehören eine 96,1-kb- und eine 12,1-kb-Region, die den CPS- und Lipopolysaccharid (LPS)-Locus umfasst, der 1182 bzw. 261 SNPs einführte und somit den Wechsel von OL101:KL47 zu O2v1:KL64 erklärt (ergänzende Abbildung 2). Es gab zusätzliche Rekombinationsereignisse, die sich über die CPS- und/oder LPS-Region erstreckten und in den von OL101:KL47/O2v1:KL64 abgeleiteten Subklonen nachgewiesen wurden, und diese führten auch zu Schaltern in den O/K-Typen.

Um die Rolle der Rekombination bei den genetischen Variationen von O2v1:KL64 und OL101:KL47 weiter abzuschätzen, haben wir die Nukleotiddivergenz für alle Genompaare innerhalb der beiden Subklone vor und nach der Entfernung rekombinanter Sequenzregionen berechnet. In O2v1:KL64 wurde eine geringere Nukleotiddivergenz festgestellt als in OL101:KL47 vor (mittlere paarweise Divergenz: 4,2 × 10–5 vs. 1,5 × 10–4; p < 2,2 × 10–16 nach Wilcoxon-Rangsummentest) und nach der Entfernung der Rekombinationsregionen (1,3 × 10–5 vs. 2,1 × 10–5; p < 2,2 × 10–16) (Ergänzende Abbildung 3). Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass O2v1:KL64 später als OL101:KL47 entstand und weniger Zeit hatte, genetische Vielfalt aufzubauen. Der r/m-Wert von O2v1:KL64 war ungefähr 2,5-fach höher als der von OL101:KL47 (17,68 gegenüber 7,28), was darauf hindeutet, dass der Beitrag der Rekombination zu den genetischen Variationen bei O2v1:KL64 höher war als bei OL101:KL47.

Angesichts des höheren r/m-Werts, der in O2v1:KL64 im Vergleich zu OL101:KL47 festgestellt wurde, und mehr Serotypen, die von O2v1:KL64 (n = 7) als von OL101:KL47 (n = 2) abgeleitet wurden, gingen wir davon aus, dass O2v1:KL64 dies getan haben könnte mit höherer Rekombinationsfähigkeit entwickelt. Um die Hypothese zu testen, untersuchten wir subklonspezifische SNPs, die mit der Rekombination assoziiert sind, und eine einzelne Missense-Mutation im recC-Gen (2804 A > G; His935Arg) wurde ausschließlich in O2v1:KL64 im Vergleich zur Sequenz von OL101:KL47 gefunden. Es ist bekannt, dass funktionelles recC für die genetische Rekombination in Escherichia coli erforderlich ist und Mutationen in recC die Rekombinationsfähigkeit beeinträchtigen können10. Wir konstruierten eine O2v1:KL64-Mutante (KP37485ΔrecC) und bestätigten, dass die Deletion von recC tatsächlich die Rekombinationsfähigkeit aufhob, die sich in der Resistenz gegen den DNA-schädigenden Wirkstoff Mitomycin C11 widerspiegelte, die durch Komplementierung mit recCO2v1:KL64 oder recCOL101:KL47 wiederhergestellt werden konnte (Abb . 3), was zeigt, dass recC an der Rekombination in K. pneumoniae ebenso beteiligt ist wie in E. coli.

Zellen der späten logarithmischen Phase, die in LB-Brühe mit 0,2 % (w/v) l-Arabinose und 25 mg/l Chloramphenicol gezüchtet wurden, wurden geerntet und in PBS resuspendiert, um 5 × 108 KBE/ml zu erhalten, gefolgt von einer Behandlung mit PBS (a) oder Mitomycin C bei 8 mg/L (b) für 1 Stunde. Die Kulturen wurden zehnfach seriell verdünnt, mit 10 μl in Reihen auf LB-Platten getupft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu validieren, ob die einzelne Missense-Mutation von recC die Rekombinationsfähigkeit beeinflussen könnte, haben wir eine isogene Mutante KP37485-recCOL101:KL47 entwickelt, indem wir recCO2v1:KL64 durch recCOL101:KL47 ersetzt haben. Abgesehen von 2804 A > G wurden keine weiteren SNPs im Genom von KP37485-recCOL101:KL47 gefunden, was durch Sequenzierung bestätigt wurde. Im Vergleich zu KP37485 wurde für KP37485-recCOL101:KL47 eine dreifache Verringerung der Resistenz gegen Mitomycin C beobachtet [Überlebensverhältnis: (1,85 ± 0,38) × 10–6 vs. (0,62 ± 0,05) × 10–6); p = 0,0295 durch t-Test], was darauf hinweist, dass die einzelne Mutation im recC-Gen einen Einfluss auf die Rekombinationsfähigkeit hat. Wir haben außerdem ein Transduktionsexperiment entworfen, um den Einfluss der beiden recC-Allele auf die Rekombinationsfrequenz zu validieren (ergänzende Abbildung 4). KP37485 zeigte eine 245-fach höhere Rekombinationsfrequenz als KP37485-recCOL101:KL47 [Mittelwert (1,38 ± 0,48) × 10–8 vs. (5,62 ± 0,44) × 10–11; p = 0,0388 durch t-Test], während homologe Rekombination in KP37485ΔrecC nicht nachweisbar war. Die Ergebnisse zeigen, dass die einzelne Missense-Mutation im recC-Gen die Rekombinationsfähigkeit deutlich verbessern kann.

Wir analysierten außerdem 14.407 K. pneumoniae-Genome, die im November 2022 aus der NCBI RefSeq-Datenbank abgerufen wurden, um die Verteilung von recCHis935Arg zu bestimmen, und das Allel wurde ausschließlich in 763 von 823 ST11 O2v1:KL64-Isolaten gefunden (Ergänzungsdatensatz 2). Bis auf eines wurden alle recCHis935Arg-positiven Isolate in China gesammelt, was darauf hinweist, dass recCHis935Arg spezifisch für chinesische ST11 O2v1:KL64-Isolate war.

Es ist bekannt, dass Rekombination und horizontaler Gentransfer für die Gestaltung der Genomstrukturen von Bakterien von entscheidender Bedeutung sind, indem sie den Austausch von genetischem Material, z. B. MGEs, beeinflussen12. Wir haben hier MGEs in den 646 ST11-Genomen analysiert, einschließlich Integrons, Insertionssequenzen (ISs), Prophagen und Plasmiden (angenähert durch Replikons), um zusätzliche Mechanismen zu identifizieren, die an der Diversifizierung von CRKP-ST11 beteiligt sind. Eine signifikant höhere Ladung an Prophagen, Replikons und ISs wurde in O2v1:KL64 im Vergleich zu OL101:KL47 gefunden (Median 9 vs. 8; 6 vs. 4 bzw. 22 vs. 18) (Wilcoxon-Rangsummentest: p = 2,2 ×). 10−16; 2,2 × 10−16; 1,87 × 10−8) (Ergänzende Abbildung 5a – d), während die Anzahl der Integronen in den beiden Subklonen mit einer signifikant unterschiedlichen Verteilung vergleichbar war (Median 2 vs. 2; p = 6,88). × 10−9) (Ergänzende Abbildung 5e). Ein ähnlicher Trend wurde zwischen ST11 und ohne ST11 festgestellt (ergänzende Abbildung 6). Um besser zu verstehen, ob die Unterschiede bei Prophagen, Plasmiden und ISs zwischen den beiden Subklonen auf vertikalen oder horizontalen Transfer zurückzuführen sind, haben wir die angestammten Zustände dieser MGEs rekonstruiert. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die großflächige Expansion von Plasmiden und ISs innerhalb von O2v1:KL64 wahrscheinlich durch ein einzelnes Akquisitionsereignis verursacht wurde (Abb. 4a, b), was das vertikale Modell unterstützt. Im Gegensatz dazu stellten wir fest, dass Unterschiede bei den Prophagen wahrscheinlich auf mehrere Erwerbs- und Verlustereignisse innerhalb von O2v1:KL64 zurückzuführen sind (Abb. 4c), was auf ein komplexeres Muster der horizontalen Übertragung schließen lässt. Diese Ergebnisse unterstützen die entscheidende Rolle von MGEs, insbesondere von Prophagen und Plasmiden, bei der Gestaltung der Populationsstruktur von CRKP-ST11.

MGE wurde als kontinuierliches Merkmal auf dem phylogenetischen Baum abgebildet, der aus den 646 ST11-Genomen berechnet wurde. Die Evolution wurde mit den Phytools des R-Pakets im Datensatz rekonstruiert, einschließlich der Anzahl der pro Genom identifizierten Plasmidreplikons (a), IS-Kopien (b), Prophagen (c) und Siphoviridae-Prophagen (d). Die Farben werden basierend auf der Anzahl der pro Genom erkannten MGEs zugewiesen, wie durch die Balken angegeben. Der Subklon O2v1:KL64 wird durch ein graues Kästchen hervorgehoben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Es ist bekannt, dass phageninduzierter Selektionsdruck eine entscheidende Rolle bei der Steuerung des Serotypwechsels von K. pneomoniae spielt13. Wir haben daher untersucht, ob das Vorhandensein und die Art der Phagen möglicherweise an der intraklonalen Diversifizierung von CRKP-ST11 beteiligt sind. Die meisten der entdeckten Prophagen (95,03 %) wurden in drei Familien eingeteilt, nämlich Myoviridae, Podoviridae und Siphoviridae. Die Ladung an Myoviridae- und Podoviridae-Prophagen war zwischen den beiden Subklonen vergleichbar (Median 92 kb; 19,8 kb), während die an Siphoviridae-Prophagen in O2v1:KL64 signifikant höher war als in OL101:KL47 (Median 95 kb vs. 60,3 kb) (p = 2,2 × 10−16 durch Wilcoxon-Rangsummentest) (Ergänzende Abbildung 5f – h). Wie bei Plasmiden und ISs resultierte die weit verbreitete Ausbreitung von Siphoviridae-Prophagen wahrscheinlich aus einem einzigen Akquisitionsereignis innerhalb von O2v1:KL64 (Abb. 4d).

Um die potenzielle Pathogenese von O2v1:KL64 und OL101:KL47 zu bewerten, wurden 154 experimentell validierte Virulenzfaktoren (VFs) von K. pneumoniae analysiert (siehe Methoden). O2v1:KL64 trug signifikant mehr Virulenzdeterminanten als OL101:KL47 (Median 97 vs. 85) (p = 2,2 × 10−16 nach Wilcoxon-Rangsummentest) (ergänzende Abbildung 7). Eine Reihe wichtiger VFs (d. h. iucABCD, terABCDEZ, peg-344, rmpADC und rmpA2), die mit Hypervirulenz assoziiert sind und typischerweise durch Virulenzplasmide8,14 mobilisiert werden, trugen hauptsächlich zu den intersubklonalen Unterschieden bei (Ergänzungsdatensatz 3), und ihre Anteile waren signifikant höher in O2v1:KL64 (56,9–71,1 %) als in OL101:KL47 (0–41,1 %) (p ≤ 2,82 × 10−9 nach Chi-Quadrat-Test für jeden paarweisen Vergleich). Bemerkenswert ist, dass rmpADC ausschließlich von O2v1:KL64 mit einer Rate von 56,9 % (240/422) übertragen wurde. Frameverschobenes rmpA und unvollständiges rmpADC wurden in 21,3 % (51/240) bzw. 9,2 % (22/240) rmpADC-positiven O2v1:KL64-Isolaten nachgewiesen. Während rmpA2 in OL101:KL47 (74/192) und O2v1:KL64 (290/422) gefunden wurde, wurde rahmenverschobenes rmpA2 in 67,6 und 98,6 % der rmpA2-positiven OL101:KL47 (50/74) und O2v1:KL64 nachgewiesen (286/290)-Isolate. Dies ähnelt unserer vorherigen Beobachtung anhand von Single-Center-Daten4. Da rmpA/A2 häufig als Indikator für Virulenzplasmide verwendet wird, haben wir die rmpA/A2-positiven Isolate hier einfach als hvKP definiert. Die O2v1:KL64-hvKP-Isolate tauchten 2015 auf und wurden in neun Provinzen nachgewiesen. Der Anteil von O2v1:KL64-hvKP unter O2v1:KL64 und CRKP-ST11 stieg dramatisch von 0 % im Jahr 2014 auf 85,9 % (158/184) bzw. 69,9 % (158/226) im Jahr 2019 (ergänzende Abbildung 8). Dies legt nahe, dass die Expansion von O2v1:KL64 mit einer Zunahme der Größe der hvKP-Population verbunden war.

Um die Existenz von Virulenzplasmiden in ST11 zu bestätigen, wurden Lesevorgänge der 646 ST11-Genome auf zwei repräsentative Virulenzplasmide pVir-KP16932 (getragen von einem ST11-OL101:KL47-Isolat) und pVir-KP47434 (getragen von einem ST11-O2v1:KL64-Isolat) kartiert ), über die in unserer vorherigen Studie berichtet wurde4, und das Vorhandensein eines Virulenzplasmids wurde abgeleitet, wenn die Abdeckung ≥40 % der Referenz betrug. Wir identifizierten 400 Isolate (61,9 %), die möglicherweise ein Virulenzplasmid tragen (Ergänzungsdatensatz 4). Davon wurden 33 Isolate (13 OL101:KL47 und 20 O2v1:KL64) mit einer Kartierungsabdeckung zwischen 40 und 100 % zufällig für die Long-Read-Sequenzierung ausgewählt, um die Diversität der Virulenzplasmide zu untersuchen (Ergänzungsdatensatz 5). Die rmpA/A2-Gene wurden auf dem Chromosom von 3 OL101:KL47-Isolaten und auf einem mutmaßlichen Virulenzplasmid in jedem der 30 Isolate nachgewiesen, deren Größe zwischen 101,5 und 305,5 kb lag (Ergänzungsdatensatz 6). Die 30 mutmaßlichen Virulenzplasmide wurden als IncFIB-HIB (n = 25), IncFIB (n = 2), IncFII-FIB-R (n = 2) und untypisierbar (n = 1) typisiert und in vier Cluster gruppiert MOB-suite15 mit AA406 als vorherrschendem Cluster (Ergänzungsdatensatz 6). Davon hatten 13 Plasmide ein relativ konserviertes Rückgrat (75,5–100 % Abdeckung), weitere 10 mit einer kleineren Größe konnten durch Gewinn oder Verlust von Genen von ihnen abgeleitet werden oder umgekehrt (67,3–100 % Abdeckung) und die anderen sieben waren Resistenz-Virulenz-Fusionsplasmide, die 1–10 antimikrobielle Resistenzgene (ARGs) mit einer geringeren Abdeckung der Virulenzplasmid-Referenzen (≤ 60 %) trugen (ergänzender Datensatz 6 und ergänzende Abbildung 9). Die Zuordnung der kurzen Sequenzablesungen von 389 rmpA/A2-positiven ST11-Isolaten zu den 30 identifizierten mutmaßlichen Virulenzplasmidsequenzen ergab 347 (89,2 %), die eine Abdeckung von ≥90 % für ein zirkularisiertes 107,1 kb großes IncFIB-Plasmid pVir-KP115906 zeigten, was die höchste Anzahl an Übereinstimmungen ergab . Diese Daten deuten darauf hin, dass die meisten rmpA/A2-positiven Isolate Virulenzplasmide enthielten. Der Vergleich der phylogenetischen Genompositionen und der Ähnlichkeiten der Plasmidsequenzen zeigte sowohl horizontale als auch vertikale Modi der Virulenzplasmidübertragung zwischen OL101: KL47 und O2v1: KL64 (ergänzende Abbildung 9).

Es ist bekannt, dass Virulenzplasmide die Pathogenität von K. pneumoniae fördern können; Wir haben hier die Phagozytose gemessen, um die Pathogenität von Isolaten ohne Virulenzplasmide zu bewerten. Die Isolate jedes Subklons wurden nach dem Vorhandensein von rmpA/A2 (dem Indikator für Virulenzplasmide) gruppiert, und drei Isolate wurden zufällig für jede Gruppe im Test ausgewählt. Tatsächlich zeigten rmpA/A2-positive Isolate beider Subklone im Vergleich zu solchen ohne Virulenzplasmide eine erhöhte Resistenz gegen Phagozytose, diese war jedoch nur für O2v1:KL64 signifikant (mittlere Phagozytose 0,017 ± 0,023 % gegenüber 0,2 ± 0,049 %; p = 0,0043 %). zweiseitiger t-Test) (Abb. 5a).

a Vergleich der Phagozytoseresistenz für Isolate ohne Virulenzplasmide (angezeigt durch das Vorhandensein von rmpA/A2). Für jede Gruppe im Test wurden drei Isolate zufällig ausgewählt, nämlich O2v1:KL64-rmpA/A2 + (KP33367, KP47434 und KP66639), O2v1:KL64-rmpA/A2- (KP33316, KP37485 und KP39199), OL101: KL47-rmpA/A2 + (KP16932, KP41051 und 46882) und OL101:KL47-rmpA/A2- (KP30412, KP43350 und KP73269). Der Assay wurde dreifach durchgeführt und die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Student-t-Tests wurden für paarweise Gruppenvergleiche verwendet und rmpA/A2-positive O2v1:KL64-Isolate zeigten eine deutlich erhöhte Resistenz gegen Phagozytose als rmpA/A2-negative O2v1:KL64-Isolate (p = 0,0043). Boxplots werden mit der Tukey-Methode angezeigt (Mittellinie, Median; Boxgrenzen, oberes und unteres Quartil; Whiskers, letzter Punkt innerhalb eines 1,5-fachen Interquartilbereichs). ns, nicht signifikant; *p < 0,01; b Verteilung der ARGs mit signifikanten Unterschieden zwischen OL101:KL47 und O2v1:KL64 ohne Virulenzplasmide. Das Resistenzverhältnis von Arzneimitteln (Ciprofloxacin, Tetracyclin und Sulfamethoxazol-Trimethoprim), die mit diesen ARGs assoziiert sind, wird verglichen. Da der Breakpoint von Tetracyclin für K. pneumoniae nicht verfügbar ist, haben wir hier eine MHK ≥ 256 mg/L verwendet, um eine hohe Resistenz darzustellen. *p < 0,01 (Chi-Quadrat-Test). c ARGs, die mit Virulenzplasmiden assoziiert sind (angezeigt durch das Vorhandensein von rmpA/A2) in OL101:KL47 (n = 192) und O2v1:KL64 (n = 422). Kreise geben Quotenverhältnisse an, die in einem einzigen multivariablen logistischen Regressionsmodell mit allen Genen geschätzt wurden; Linien geben 95 %-Konfidenzintervalle für diese Quotenverhältnisse an. Der Median wurde als Maß für die Mitte der Fehlerbalken in den Feldern a und c verwendet. Alle durchgeführten statistischen Tests waren zweiseitig. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um herauszufinden, ob Antibiotika an der subklonalen Selektion beteiligt waren, analysierten wir erworbene Antibiotikaresistenzgene (ARGs) für beide Subklone. Die Anzahl der erworbenen ARGs war zwischen O2v1:KL64 (Median 11) und OL101:K47 (Median 10) vergleichbar (p = 0,96 nach Wilcoxon-Rangsummentest) (ergänzende Abbildung 10). Allerdings war bei diesen mit einem Anteil von ≥ 50 % in jedem Subklon die Häufigkeit von oqxAB in OL101:KL47 signifikant höher (p ≤ 5,69 × 10−12 gemäß Chi-Quadrat-Test), während die von blaLAP-2, dfrA-like, qnr-like, sul-like und tet(A) waren in O2v1:KL64 signifikant höher (p ≤ 1,23 × 10−3 nach Chi-Quadrat-Test) (Abb. 5b und ergänzender Datensatz 7). Es wurde eine starke Korrelation zwischen dem Vorhandensein dieser ARGs und rmpA/A2 in O2v1:KL64 (p < 2,2 × 10−16), jedoch nicht in OL101:KL47 (p ≥ 0,05) gefunden (Abb. 5c). Darüber hinaus haben wir die MHK von Ciprofloxacin, Tetracyclin und Sulfamethoxazol-Trimethoprim für 368 O2v1:KL64- und 140 OL101:K47-Isolate gemessen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede für die Ciprofloxacin-Resistenz zwischen O2v1:KL64 und OL101:K47 (p ≥ 0,95 im Chi-Quadrat-Test) gefunden (Abb. 5b), da alle Isolate eine gyrA-Mutante (Asp87Gly) und eine parC-Mutante (Ser80lle und Asn438Ser) enthielten ). Allerdings wies die O2v1:KL64-hvKP-Population die höchste Resistenzrate gegen Tetracyclin und Sulfamethoxazol-Trimethoprim auf (Abb. 5b).

Um zu verstehen, wie diese ARGs erfasst wurden, führten wir eine Long-Read-Sequenzierung für 17 Isolate (14 O2v1:KL64; 3 OL101:KL47) durch, die mindestens zwei von blaLAP-2, dfrA-like, qnr-like, sul-like und trugen tet(A)-Gene. Diese ARGs wurden auf den Replikon-kodierenden Contigs der 17 Genomen nachgewiesen, was belegt, dass sie von Plasmiden stammen (ergänzender Datensatz 8). Diese mutmaßlichen Plasmide wurden drei Inc-Typen zugeordnet (IncFII, IncFII-FIB und IncFII-R), wobei IncFII vorherrschend war (13/18). Jeder Plasmidtyp hatte unabhängig vom Wirt ein konserviertes Rückgrat gemeinsam, was auf intersubklonale horizontale Transfers schließen lässt (ergänzende Abbildung 11a). Die Kartierung der Lesevorgänge der Genomen OL101:KL47 und O2v1:KL64 auf diese mutmaßlichen Plasmide ergab, dass das Plasmid vom IncFII-Typ in O2v1:KL64 vorherrschte (266 Genome zeigten eine Abdeckung von >90 % für pMDR-KP29007), insbesondere in O2v1:KL64-hvKP (241/266), aber selten in OL101: KL47 (12 Genome zeigten eine Abdeckung von> 90% für pMDR-KP29007) (Ergänzende Abbildung 11b).

Angesichts der Tatsache, dass durch die genetische Vielfalt der oben beschriebenen Virulenzplasmide vom IncFIB-Typ und MDR-Plasmide vom IncFII-Typ in O2v1:KL64 unterschiedliche Genotypen verliehen wurden, wollten wir erfolgreiche Genotypen im Kontext der assoziierten Gene identifizieren, die von diesen Plasmiden getragen werden (Abb. 6). Basierend auf verschiedenen Kombinationen dieser Gene wurden insgesamt 48 Genotypen nachgewiesen. Die am weitesten verbreiteten Genotypen (Genotypen 1 und 2) kodieren alle Gene außer dfrA-like und/oder oqxAB und machen 47,9 % (202/422) von O2v1:KL64 aus (Abb. 6a) und das Verhältnis der beiden Genotypen in jedem Jahr stieg zwischen 2014 und 2019 dramatisch von 0 % auf 64,7 % (119/184) (Abb. 6b), was darauf hindeutet, dass es sich bei beiden um erfolgreiche Genotypen handeln könnte. Im Gegensatz dazu tragen der dritte und vierte vorherrschende Genotyp (Genotyp 3 und 4) keine Zielgene oder kodieren lediglich für oqxAB (Abb. 6a), und ihr Anteil an der Population nahm vom Höchststand (63 %; 17/27) im Jahr ab 2015 auf 4,9 % (9/184) im Jahr 2019 (Abb. 6b).

a Die Kombinationsmatrix (unten) zeigt die vorhergesagten Genotypen von O2v1:KL64. Innerhalb der Kombinationsmatrix zeigen schwarze Kreise das Vorhandensein von Genen an und die vertikale Kombination schwarzer Kreise stellt den Genotyp dar. Die Gesamtzahl jedes Genotyps ist unterhalb der Matrix angegeben. Die Kombinationsmatrix wurde mit dem UpSetR-Paket73 erstellt. Das Blasendiagramm (oben) zeigt die relative Anzahl der Isolate mit jedem Genotyp (Kombinationsmatrix) pro Jahr. b Die Grafik zeigt die relative Häufigkeit der Genotypen 1 und 2 sowie der Genotypen 3 und 4 pro Jahr. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu verstehen, ob der subklonale Ersatz mit einem veränderten Übertragungsmuster, d. h. einer Übertragung innerhalb und zwischen Krankenhäusern, verbunden ist, haben wir versucht, wahrscheinliche aktuelle Übertragungsereignisse mithilfe paarweiser SNP-Abstände nach Jahr (2014–2019) zu unterscheiden. Wir haben eine Reihe von SNP-Schwellenwerten getestet, um die Verzerrung zu minimieren, die möglicherweise durch einen einzelnen Grenzwert entsteht. Der minimale SNP-Schwellenwert wurde basierend auf der Mutationsrate unserer Sammlung und der Referenzgenomlänge (siehe Methoden) auf 14 SNPs festgelegt, und der maximale Schwellenwert wurde basierend auf aktuellen regionalen epidemiologischen Studien auf 25 SNPs festgelegt7,16,17,18.

Für O2v1:KL64 wurde von 2015 bis 2019 eine signifikante Verschiebung des Übertragungsmusters beobachtet (2014 wurde aufgrund der begrenzten Anzahl erhaltener Isolate in der Analyse ausgeschlossen), wobei jeder Schwellenwert von 14–25 SNPs verwendet wurde. Der Anteil der jüngsten Übertragungen innerhalb von Krankenhäusern sank dramatisch von (100–89,7 %) auf (71,5–40,9 %) für O2v1:KL64, während der Anteil zwischen Krankenhäusern dramatisch von (0–10,3 %) auf (28,5–59,1 %) anstieg (S < 0,05 nach Mann-Kendall-Test) (Abb. 7). Eine ähnliche Übertragungsdynamik wurde für die O2v1:KL64-hvKP-Population beobachtet (z = 2,02; p < 0,05 nach Mann-Kendall-Test), jedoch nicht für die rmpA/A2-negativen Isolate (Abb. 7). Dies deutet darauf hin, dass die hypervirulente Subpopulation die Verbreitung von O2v1:KL64 durch verstärkte Übertragungen zwischen Krankenhäusern förderte. Eine relative Stabilität wurde im Anteil der jüngsten Übertragungen innerhalb ([100–98,6 %]–[100–83,3 %]) und zwischen Krankenhäusern ([0–1,4 %]–[0–16,7 %]) für OL101:K47 aus dem Jahr 2014 beobachtet bis 2019 (p > 0,05 nach Mann-Kendall-Test) (Abb. 7), was darauf hindeutet, dass das Übertragungsmuster von OL101:K47 im Laufe der Zeit keine signifikanten Änderungen aufwies.

Aktuelle Intra- und Inter-Facility-Übertragungspaare mithilfe paarweiser Einzelnukleotid-Polymorphismus-Abstände (SNP) wurden nach Jahr identifiziert. Kreise geben den Anteil der Paare (y-Achse) an, der unter Verwendung verschiedener paarweiser SNP-Abstandsschwellenwerte (x-Achse) berechnet wurde. In dieser Studie wurde eine Reihe von Schwellenwerten (14–25 SNPs; eine Grauzone) verwendet (siehe Methoden), um aktuelle Übertragungspaare innerhalb und zwischen Einrichtungen für OL101:KL47 (die oberen beiden Reihen) oder O2v1:KL64 (die beiden oberen Reihen) zu identifizieren die beiden unteren Reihen). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die geografische Epidemiologie und die evolutionäre Beziehung von ST11 auf subklonaler Ebene zu analysieren, wurde eine phylogenetische Analyse unter Verwendung der 646 ST11-Genome zusammen mit 329 öffentlich verfügbaren Entwurfsgenomen von ST11 durchgeführt, die in 43 Ländern auf vier Kontinenten (d. h. Amerika, Afrika, Asien, und Europa) (Ergänzungsdatensatz 9). Bis auf zwei chinesische Isolate fallen alle in eine einzige Klade, wobei sieben Isolate aus Frankreich (angeblich aus China importiert19), Kanada, den Vereinigten Staaten und Japan stammen (ergänzende Abbildung 12), was darauf hindeutet, dass sich der ST11-Klon unabhängig voneinander entwickelt und lokal ausgebreitet hat China. Drei O3b:KL13-Isolate aus den Vereinigten Staaten, geclustert mit der chinesischen Gruppe.

Die meisten der globalen ST11-Isolate (269/329) wurden sechs Hauptunterlinien zugeordnet (ergänzende Abbildung 12), darunter O2v1:KL24 (n = 66), O2v1:KL64 (n = 21), O2v2:KL27 (n = 36). ), O2v2:KL105-Isolate (n = 73), O3:KL125 (n = 17) und O4:KL15 (n = 56). Diese Unterlinien zeigten geografische Besonderheiten: (i) O4:KL15, O2v1:K24 und O3b:KL125, da sich internationale Unterlinien in mehreren Ländern auf ≥3 Kontinenten ausgebreitet haben (n = 18 auf fünf Kontinenten; n = 19 auf vier Kontinenten; n = 4 auf drei Kontinenten); (ii) O2v2:KL105 zirkulierte hauptsächlich in Europa, insbesondere Osteuropa (59/73), und O2v2:KL27-Isolate wurden hauptsächlich in Nord- und Südamerika nachgewiesen, was auf zwei Kontinente schließen lässt; (iii) O2v1:KL64 wurde hauptsächlich in Brasilien (18/21) als lokale Unterlinie gefunden. Bemerkenswert ist, dass sich die brasilianischen O2v1:KL64-Isolate phylogenetisch von denen aus China unterschieden, was auf eine unabhängige Entwicklung dieses Subklons hinweist.

Die BEAST-Analyse wurde unter Verwendung von 147 der 975 Genomen durchgeführt, um die Rechenzeit zu verkürzen (siehe Methoden) (ergänzende Abbildung 13). Die Korrelation zwischen den Abständen von Wurzel zu Spitze und der Probenahmezeit deutete auf ein relativ uhrartiges Muster der molekularen Entwicklung hin (ergänzende Abbildung 14). O2v1:KL64 wurde um 2006 n. Chr. (95 % HPD n. Chr. 2004–2009) in China von OL101: KL47 abgeleitet, und OL101: KL47 entstand um 2005 n. Chr. (95 % HPD n. Chr. 2002–2008). Der jüngste gemeinsame Vorfahre (MRCA) der globalen und chinesischen Isolate datiert auf etwa 1983 n. Chr. (95 % HPD n. Chr. 1977–1989).

Die schnelle weltweite Verbreitung von CRKP wird größtenteils durch eine Reihe „äußerst erfolgreicher“ Klone vorangetrieben, darunter ST11. Allerdings sind die Faktoren, die der erfolgreichen Epidemieausbreitung zugrunde liegen, nach wie vor kaum verstanden. Die Verfolgung der genetischen und phänotypischen Variationen von Isolaten über einen weiten Zeit- und geografischen Bereich hinweg ermöglicht es uns, den Evolutionsverlauf zu untersuchen und die zugrunde liegenden Triebkräfte zu erforschen.

Wir haben zuvor in einem tertiären Krankenhaus eine subklonale Verschiebung von CRKP-ST11 festgestellt, die Blutkreislaufinfektionen verursachte4. In dieser Studie haben wir die subklonale Verschiebung im Rahmen einer 6-jährigen nationalen Prävalenzerhebung weiter nachgewiesen. CRKP-ST11 hat sich in zwei große Subklone (OL101:KL47 und O2v1:KL64) diversifiziert, und OL101:KL47 wurde im Laufe der Zeit schrittweise durch O2v1:KL64 ersetzt. Die intraklonale Segregation würde um das Jahr 2006 n. Chr. erfolgen (ergänzende Abbildung 13) und war hauptsächlich auf die Rekombination von Kapsel- und LPS-Biosyntheseorten zurückzuführen, die als Rekombinations-Hotspots definiert wurden, die einer starken diversifizierenden Selektion in K. pneumoniae unterliegen8. 20. Aus epidemiologischer Sicht ist es äußerst interessant, den Selektionsdruck für die Prävalenz von O2v1:KL64 zu bestimmen. In Übereinstimmung mit unseren Daten, dass O2 in ST11 und ST15 vorherrschte, zeigte eine frühere Studie, dass der O2-Serotyp in den letzten zwei Jahrzehnten bei CRKP dominant war (50 %), insbesondere bei einem anderen epidemischen Klon ST25821. Die Prävalenz des O2-Antigens korreliert vermutlich mit einem Mangel an Anti-O2-Antikörpern im menschlichen B-Zell-Repertoire21. Zusätzliche Studien berichteten, dass Patienten mit O2v1:KL64-CRKP-BSI eine signifikant höhere 30-Tage-Mortalitätsrate und eine höhere Inzidenzrate von Sepsis/septischem Schock aufwiesen4,22. Diese legen nahe, dass das Auftreten von O2v1:KL64 mit der Anfälligkeit des Wirts zusammenhängt, was zu einer erhöhten Pathogenität durch Umgehung der angeborenen Wirtsabwehr führt. Daher wird die identifizierte subklonale Verschiebung innerhalb von CRKP-ST11 wahrscheinlich zu Herausforderungen für die aktuellen Messungen und Behandlungsstrategien zur Infektionskontrolle führen.

Bei mehreren berüchtigten MDR-Erregern wurde über einen klonalen Ersatz berichtet, und eines der bekannteren Beispiele ist Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA)23,24. Entwickelte Resistenzen und Virulenz im Zusammenhang mit einer Reihe genetischer Veränderungen wurden mit dem klonalen Ersatz von MRSA in Verbindung gebracht25,26,27. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass der epidemische Erfolg von O2v1:KL64 mit der Ausbreitung einer hypervirulenten Abstammungslinie mit dem Einfangen eines Virulenzplasmids verbunden ist. Die neu auftretenden O2v1:KL64-hvKP-Isolate wurden sporadisch in mehreren Überwachungsumfragen gemeldet28,29; Allerdings hat keiner von ihnen die epidemiologischen und evolutionären Charakterisierungen der Abstammungslinie systematisch untersucht. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Virulenzplasmide die Pathogenität von K. pneumoniae30,31,32 fördern können. Tatsächlich haben wir hier festgestellt, dass O2v1:KL64-hvKP im Vergleich zu Isolaten ohne Virulenzplasmide eine erhöhte Phagozytoseresistenz aufweist. Unsere vorherige Studie zeigte, dass Virulenzplasmide die Invasion von Krankheitserregern und die anschließende klinische Infektion förderten und O2v1:KL64-hvKP eine erhöhte Resistenz gegen die Abtötung von Neutrophilen aufwies4. Zusammengenommen bestätigen ihre Daten, dass sich O2v1:KL64-hvKP durch das Einfangen von Virulenzplasmiden virulenter entwickelt hat. Das Auftreten von O2v1:KL64-hvKP ist zusätzlich mit dem Einfangen von MDR-Plasmiden verbunden. Es wurde eine starke Korrelation zwischen fünf ARGs [dh blaLAP-2, dfrA-like, qnr-like, sul-like und tet(A)] und O2v1:KL64-hvKP, aber nicht OL101:KL47 gefunden (Abb. 5c). Dies ist auf die Anreicherung eines IncFII-MDR-Plasmids zurückzuführen. Im Vergleich zu den anderen Subpopulationen zeigte O2v1:KL64-hvKP die höchste Resistenz gegen Tetracyclin und Sulfamethoxazol-Trimethoprim (Abb. 5b), was darauf hindeutet, dass diese beiden Arzneimittel möglicherweise an der Prävalenz von O2v1:KL64-hvKP beteiligt waren. O2v1:KL64 und OL101:KL47 zeigten aufgrund von Mutationen in gyrA oder parC eine vergleichbare Resistenz gegen Ciprofloxacin, während in O2v1:KL64 zusätzlicher Verlust und Gewinn von oqxAB- bzw. qnr-ähnlichen Genen festgestellt wurde. Bemerkenswert ist, dass oqxAB allgemein als Kerngene von K. pneumoniae6 angesehen wird, unsere Ergebnisse zeigten jedoch, dass sie in den meisten O2v1:KL64-Isolaten verloren gingen, möglicherweise durch IS-vermittelte und/oder Rekombinationsmechanismen (ergänzende Abbildung 15). . Als Multidrug-Efflux-Pumpe verleiht OqxAB eine geringe bis mittlere Resistenz gegen mehrere Antibiotika (z. B. Chinoxaline, Chinolone, Tigecyclin und Nitrofurantoin), Reinigungs- und Desinfektionsmittel. Der Verlust von OqxAB kann die Arzneimittelresistenz von O2v1:KL64 beeinträchtigen. Ob ein solcher Verlust dem epidemischen Erfolg evolutionäre Vorteile verleihen könnte, muss weiter untersucht werden.

Bei Bakterien gelten Rekombination, horizontaler Gentransfer und Mutationen als Hauptquellen für die in eine Population eingeführten genetischen Variationen. Wie auch bei anderen vorherrschenden MDR-Klonen (z. B. ST258 und ST15)8 wurden die Genome von ST11 durch häufige Rekombinationsereignisse geformt. Insbesondere deutete unsere Analyse darauf hin, dass der Beitrag der Rekombination zu den genetischen Variationen in O2v1:KL64 höher war als in OL101:KL47, und wir zeigten außerdem, dass eine in recC von O2v1:KL64 auftretende Punktmutation eine höhere Rekombinationskompetenz verlieh, was einzigartig war zu O2v1:KL64 isoliert in China. Es ist bekannt, dass recC zusammen mit recB und recD eine ATP-abhängige Nuklease namens RecBCD-Enzym kodiert und der RecBCD-abhängige Weg der primäre Mechanismus der homologen Rekombination und Reparatur linearer doppelsträngiger DNA in E. coli ist. Die Struktur und Funktion des RecBCD-Enzyms wird durch Chi-Stellen (5′-GCTGGTGG-3′) reguliert, um die Rekombination zu stimulieren33. Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die RecC-Untereinheit Chi im 3′-Tunnel erkennt34 und eine 35 kDa große C-terminale Domäne von RecC für die Interaktion mit dem RecD-Protein erforderlich ist, eine Voraussetzung für die Reaktion auf Chi35. Punktmutationen in der C-terminalen Domäne von RecC verhindern indirekt die Assoziation von RecD mit RecBC35, was zum „Double-Dolch“-Phänotyp führt: von Chi unabhängige Rekombinationsfähigkeit und das Fehlen von Nukleaseaktivitäten36. Bemerkenswert ist, dass sich die in RecC von O2v1:KL64 auftretende Punktmutation (His935Arg) in der C-terminalen Domäne befindet; Wir schließen daher, dass es die Interaktion mit RecD und die Reaktion auf Chi beeinflussen kann, um die Rekombination zu stimulieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Mutationen, die das recB- oder recC-Gen inaktivieren, zu Defekten in mehreren biologischen Funktionen führen, einschließlich Konjugation, Transduktion und Phagenrekombination; ein Verlust der SOS-Induktion; Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Stoffen, die DSBs verursachen; und geringe Lebensfähigkeit der Zellen37. Wir schlagen daher vor, dass die O2v1:KL64-Population, die die recC-Mutation trägt, durch häufigere Rekombination und durch das Einfangen von mehr MGEs, wie in dieser Studie nachgewiesen, vielfältiger geworden ist und O2v1:KL64-hvKP in kurzer Zeit ausgewählt wurde und vorherrscht Skala.

Darüber hinaus wurde der horizontale Gentransfer als eine weitere treibende Kraft für die Diversifizierung in ST11 identifiziert, da in O2v1:KL64 im Vergleich zu OL101:KL47 eine signifikant höhere Ladung an MGEs, einschließlich Plasmiden, ISs und Prophagen, nachgewiesen wurde (ergänzende Abbildung 5a). -D). Es ist bekannt, dass phageninduzierte Selektionsdrücke eine entscheidende Rolle für die Populationsvielfalt von Bakterien spielen13, und wir fanden heraus, dass die Prophagenlast in O2v1:KL64 aufgrund mehrerer Gewinn- und Verlustereignisse signifikant höher war als in OL101:KL47 (Abb. 4c). ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die beiden Subklone möglicherweise heterogen unterschiedlichen Phagentypen ausgesetzt waren. Unsere Analyse zeigt insbesondere, dass Siphoviridae-Prophagen erheblich zur hohen Prophagenlast in O2v1:KL64 beitrugen, die wahrscheinlich auf ein einzelnes Erfassungsereignis durch das vertikale Modell zurückzuführen ist (Abb. 4d). In ähnlicher Weise war die groß angelegte Expansion von Plasmiden und ISs innerhalb von O2v1:KL64 auch mit einem einzelnen Akquisitionsereignis verbunden, gefolgt von einer vertikalen Vererbung (Abb. 4b, c). Die vertikale Übertragung dieser MGEs legt nahe, dass sie O2v1:KL64 möglicherweise evolutionäre Vorteile verschafft haben, was durch die identifizierten „erfolgreichen“ Genotypen, die diese MGEs tragen, weiter gestützt werden könnte (Abb. 6). Angesichts der Tatsache, dass ST11-Genome in unserer Sammlung mehr MGEs enthalten als Nicht-ST11-Genome (ergänzende Abbildung 6), schlagen wir vor, dass die Anhäufung von Prophagen und Plasmiden einer der entscheidenden Faktoren für den epidemischen Erfolg erfolgreicher Klone sein könnte. Trotz der Vorteile, die von MGEs getragene Frachtgene (z. B. AMRs) bieten können, würde die Einführung neuer MGEs in einen bereits vorhandenen, gut abgestimmten genetischen Hintergrund Fitnesskosten verursachen, und die Aufrechterhaltung von MGEs in Wirtszellen erfordert ein Gleichgewicht der Kosten und Vorteile für den Gastgeber38, z. B. im Laufe der Zeit durch Auswahl minimiert39. Es wäre interessant, die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, die O2v1:KL64 zur Feinabstimmung der durch diese MGEs verursachten Fitnesskosten verwendet. Darüber hinaus sollten zukünftige Studien die Untersuchung der biologischen Funktion dieser genetischen Elemente umfassen, um ihre Rolle für den Erfolg von O2v1:KL64 auf Populationsebene zu verstehen.

Noch besorgniserregender ist, dass wir mithilfe einer SNP-basierten Übertragungsverfolgungsmethode festgestellt haben, dass die Prävalenz von O2v1:KL64-hvKP auf einem veränderten Übertragungsmuster beruht. Die Genauigkeit von SNP-basierten Übertragungsverfolgungsmethoden wurde kürzlich durch zahlreiche Studien belegt, die große Datensätze für verschiedene Krankheitserreger wie MRSA und CRKP verwendeten7,16,40. Insbesondere haben wir hier eine Reihe von SNP-Grenzwerten verwendet, um jegliche Verzerrung zu vermeiden, die durch einen einzelnen Grenzwert verursacht werden könnte. Tatsächlich erzeugten alle in unserer Analyse verwendeten SNP-Grenzwerte einen konsistenten Übertragungstrend, was die Zuverlässigkeit und Gültigkeit unserer Ergebnisse demonstrierte. Die Verbreitung von O2v1:KL64-hvKP wurde hauptsächlich durch eine Übertragung innerhalb des Krankenhauses vor 2018 vorangetrieben, was auf evolutionäre Vorteile zurückzuführen sein könnte, die durch eine Reihe genetischer Veränderungen, wie hier identifiziert, verliehen wurden. Mit der zunehmenden Größe von O2v1:KL64-hvKP im Laufe der Zeit haben Patiententransfers zwischen Krankenhäusern möglicherweise die Ausbreitung der Teilpopulation im ganzen Land weiter erleichtert, was zu einer anschließenden Umstellung auf die Übertragung zwischen Krankenhäusern geführt hat. Um die Gründe für Änderungen im Übertragungsmodus in der Zukunft aufzudecken, sind weitere Metadaten erforderlich. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die aktuellen Maßnahmen zur Infektionskontrolle anzupassen (z. B. aktives Screening von zwischen Krankenhäusern verlegten Patienten mit CRKP in der Vorgeschichte), um die Verbreitung von O2v1:KL64-hvKP in China zu verhindern.

Zusammenfassend haben wir hier gezeigt, dass der subklonale Ersatz innerhalb von CRKP-ST11 durch die Expansion von O2v1:KL64 innerhalb eines Zeitraums von 6 Jahren in China vorangetrieben wurde. Der epidemische Erfolg von O2v1:KL64 ist mit der Entstehung und Verbreitung einer Subpopulation verbunden, die mit einem Repertoire genetischer Veränderungen verbunden ist, und – was noch besorgniserregender ist – mit der verstärkten Übertragung zwischen Krankenhäusern. Insgesamt unterstreicht unsere Studie, dass sich die Bemühungen der öffentlichen Gesundheit auf die Genomüberwachung konzentrieren sollten, um Hochrisikoklone und subklonale Expansionen frühzeitig im Verlauf einer Epidemie zu identifizieren und gezielte Kontrollstrategien zu verstärken.

Im Rahmen der nationalen Überwachung von Blutisolaten (Blood Bacterial Resistance Investigation Collaborative System, BRICS) wurden zwischen Januar 2014 und Dezember 2019 in China insgesamt 4635 nicht doppelte Isolate gesammelt (Abb. 1a). Während des gesamten Studienzeitraums kam pro Patient nur das erste Blutisolat jeder Spezies in Frage. Alle teilnehmenden Krankenhäuser schickten vierteljährlich ihre Isolate an das Zentrallabor. Die Artenidentifizierung erfolgte mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS) (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland). Der Anstieg der Anzahl der Isolate im Laufe der Zeit war teilweise auf Verbesserungen der Qualitätskontrolle durch die teilnehmenden Krankenhäuser während des Überwachungszeitraums zurückzuführen. Das Probenentnahmeprotokoll wurde vom Institutional Review Board des First Affiliated Hospital der Zhejiang University in China genehmigt.

Die Empfindlichkeitstests gegen antimikrobielle Mittel wurden zunächst mit einem VITEK-2-System (bioMérieux, Lyon, Frankreich) in den Sentinel-Krankenhäusern durchgeführt und durch die Agar-Verdünnungs- und/oder Brühen-Mikroverdünnungsmethode in unserem Labor weiter bestätigt. Die Ergebnisse wurden gemäß dem Clinical and Laboratory Standards Institute41 und dem European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing v.10.0 (http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/) interpretiert. Die Carbapenem-Resistenz wurde als minimale Hemmkonzentration (MHK) von ≥4 mg/l für Imipenem oder Meropenem definiert.

Genomische DNA aus 794 CRKP-Isolaten wurde mit Gentra Puregene Yeast/Bact extrahiert. Kit (Qiagen, San Francisco/Bay Area, CA, USA). Die Genome wurden unter Verwendung eines Illumina Novaseq 6000-Systems (Illumina, San Diego, USA) mit 2 × 150-bp-Paired-End-Bibliotheken sequenziert. Rohdaten wurden mit Trimmomatic v0.3342 gekürzt und dann mit SPAdes v3.12.043 zusammengestellt. Wir führten eine Long-Read-Sequenzierung an repräsentativen Isolaten unter Verwendung einer Nanopore PromethION-Plattform (Nanopore, Oxford, UK) nach einem 10-Kbp-Bibliotheksprotokoll durch. Mit Unicycler 0.4.044 wurde eine Hybridbaugruppe mit kurzen und langen Lesevorgängen generiert. QUAST v4.6.045 wurde zur Generierung von Montagestatistiken verwendet. Die Arten wurden mit FastANI v1.33 (https://github.com/ParBLiSS/FastANI) mit einem Cut-off von 95 % bestimmt. Die Baugruppen wurden mit Prokka v1.14.646 kommentiert.

Die STs wurden mit Kleborate v2.0.147 zugewiesen und der K/O-Typ wurde mit Kaptive v1.048 aus der De-novo-Assembly bestimmt.

ARGs wurden mit Abricate v1.0.1 (https://github.com/tseemann/abricate) mit der ARG-Datenbank ResFinder v4.049 erkannt. Die VFs von K. pneumoniae wurden aus der K. pneumoniae BIGSdb50 und Virulence Factor Database 2019 (VFDB)51 heruntergeladen und das Vorhandensein von VFs wurde mit BLASTp v2.6.0 (Identität ≥70 %) erkannt, wobei die benutzerdefinierte VF-Datenbank 154 VF enthielt Gene (Ergänzungsdatensatz 3). Die Replikontypisierung wurde mit Abricate v1.0.1 mit der PlasmidFinder-Datenbank52 durchgeführt. Das Vorhandensein von Integronen wurde mit IntegronFinder v1.5.153 erkannt. Die Anzahl der IS-Kopien wurde mit der TPM-Aufruffunktion von TPMCalculator v0.0.354 geschätzt und mit dem TPM von GapA (einem Housekeeping-Gen) korrigiert. Die Prophagen wurden mit Phigaro v2.2.655 erkannt und klassifiziert. Der angestammte Zustand jedes MGEs wurde mit maximaler Wahrscheinlichkeit mithilfe der Funktion fastAnc im R-Paket phytools v.0.4-9856 rekonstruiert.

Die Rekombinationsanalyse wurde mit Gubbins v2.257 durchgeführt. Die Gubbins-Ausgabedateien wurden zur Berechnung von r/m und der mittleren Rekombinationszahl pro Base verwendet, berechnet über nicht überlappende 1000-bp-Fenster. Die paarweise Nukleotiddivergenz zwischen subklonspezifischen Kerngenomregionen wurde für jedes Genompaar innerhalb eines Subklons vor und nach der Entfernung mutmaßlicher rekombinanter Regionen berechnet.

Für die Genmanipulation wurde ein repräsentatives O2v1:KL64-Isolat KP37485 verwendet. Alle in dieser Studie verwendeten Primer wurden im Ergänzungsdatensatz 10 aufgeführt. Für die Knockout-Konstruktion wurde das recC-Spacer-DNA-Fragment in einen pSGKP-apr-Vektor kloniert58 und das synthetische Oligonukleotid mit 45 nt für jede Homologieverlängerung des Zielgens wurde verwendet als Spendervorlage. Sowohl das pSGKP-recC-Spacer-Plasmid als auch die Donor-Matrizen-DNA wurden durch Elektroporation in pCasKP-tragendes KP37485 transformiert, und die Integration wurde auf LB-Platten mit 5 % Saccharose bei 37 °C selektiert. Für den Genaustausch wurde ein lineares Fragment, das ein Katzengen mit seinem nativen Promotor aus Plasmid pKD359 zwischen den 45 nt jeder Homologieverlängerung von recC enthielt, amplifiziert und als Donor-Matrize verwendet, und das resultierende KP37485-recC::cat-pCasKP wurde ausgewählt auf LB-Platten mit 5 % Saccharose plus 25 mg/L Chloramphenicol und 30 mg/L Apramycin bei 30 °C. Das synthetische Oligonukleotid mit recCOL101:KL47 sowie seine jeweils 45 nt große Homologieverlängerung wurden als Donor-Matrize verwendet und mit dem Plasmid pSGKP-cat-spacer in KP37485-recC::cat-pCasKP transformiert. Die Integration wurde wie in der Knockout-Konstruktion beschrieben ausgewählt und zusätzlich nach der Chloramphenicol-Empfindlichkeit ausgewählt. Zur Komplementierung wurden Gene mittels PCR amplifiziert und in den Vektor pBAD3360 kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden durch Elektroporation in kp37485ΔrecC eingeführt. Zur Bestätigung der endgültigen Konstruktionen wurden PCR und DNA-Sequenzierung verwendet.

Die rekombinatorische Reparatur von DNA-Schäden, die durch den Rec-abhängigen Weg vermittelt werden, ist bekanntermaßen eine primäre Strategie zum Schutz von Bakterien vor DNA-schädigenden Stoffen (z. B. Mitomycin C, Ethidiumbromid und UV); Daher wurden diese Wirkstoffe häufig als Indikatoren für die Rekombinationsfähigkeit verwendet11,35,61. Die Mitomycin-C-Resistenz wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen bewertet61. K. pneumoniae-Isolate wurden über Nacht in LB-Brühe gezüchtet und mit den angegebenen Wirkstoffen in die frische Brühe geimpft. Stämme, die pBAD33 und seine abgeleiteten Plasmide enthielten, wurden in LB-Brühe mit 0,2 % (Gew./Vol.) l-Arabinose und 25 mg/l Chloramphenicol gezüchtet. Die Bakterien wurden in der späten logarithmischen Phase geerntet und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert, bis zu 5 × 108 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Milliliter. Zellsuspensionen wurden 1 und 3 Stunden lang mit Mitomycin C in den angegebenen Konzentrationen behandelt, seriell in PBS verdünnt, auf LB-Platten verteilt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Als Negativkontrolle wurden mit PBS behandelte Bakterien verwendet. Das Überlebensverhältnis wurde wie folgt berechnet: (KBE der mit Mitomycin C behandelten Kultur/KBE der mit PBS behandelten Kultur) × 100 %.

Der Suizidvektor pRE118, der das Upstream- und Downstream-Fragment von blaKPC-2 des KP37485 und ein Apramycin-Resistenzgen apmR trägt, wurde erzeugt und in getestete Wirte elektroporiert. Rekombinanten wurden auf 50 mg/L Apramycin enthaltenden Platten ausgewählt und durch PCR weiter bestätigt. Die Rekombinationshäufigkeit wurde als Anzahl der Rekombinanten/Anzahl der Empfänger berechnet.

Der Phagozytosetest wurde wie zuvor in Lit. beschrieben durchgeführt. 62. Kurz gesagt, THP-1-Zellen wurden in einer Platte mit 12 Vertiefungen mit 1 × 106 Zellen/Vertiefung differenziert. Bakterien in der mittleren Log-Phase wurden durch Zentrifugation (5 Min., 6000 U/min, 24 °C) geerntet, in 1 × PBS resuspendiert und auf 5 × 108 KBE/ml eingestellt. Infektionen wurden mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 50 Bakterien pro Zelle durchgeführt. Um die Infektion zu synchronisieren, wurden die Platten 5 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert und bei 37 °C in einer angefeuchteten 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert. Nach einer Stunde Kontakt wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit RPMI 1640, das 10 % FBS und Gentamicin (100 mg/l) enthielt, kultiviert. Um die Bakterienlast in der Zelle zu bestimmen, wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 0,5 % Saponin in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Zur Quantifizierung der Anzahl intrazellulärer Bakterien wurden serielle Verdünnungen auf LB ausplattiert. Alle Experimente wurden mit dreifachen Proben bei mindestens drei unabhängigen Gelegenheiten durchgeführt.

Short-Read-Assemblys wurden mit BLASTn v2.9.063 gegen Referenzplasmide gestrahlt, um die Länge der in allen Isolaten vorhandenen Referenzplasmidsequenz zu bestimmen. Die Replikontypisierung und das Clustering wurden mit MOB-suite15 durchgeführt. Repräsentative Plasmide wurden mittels PCR und Sanger-Sequenzierung zirkularisiert. Das Artemis-Vergleichstool v13.0.064 und/oder BRIG65 wurde verwendet, um strukturelle Variationen zwischen zwei oder mehr Sequenzen zu vergleichen und zu visualisieren. Die Heatmap, die den Prozentsatz ausgerichteter Regionen zwischen Paaren von Virulenzplasmiden zeigt, wurde mit dem Paket „pheatmap“ (v1.0.12) in R v4.1.1 (https://www.r-project.org/) erstellt.

Gekürzte Sequenzierungsablesungen von 646 in dieser Studie gesammelten ST11-Isolaten wurden unter Verwendung von BWA mem 62 v0.7.10-r789 (Standardparameter) einem K. pneumoniae ST11-Referenzgenom KP16932 (Zugangsnummer QVAN00000000)4 zugeordnet. Zugeordnete Lesevorgänge wurden dann mit der SAMtools-Suite v1.766 bereinigt und sortiert. Lesevorgänge wurden mithilfe von GATK v3.767 anhand der Referenz neu ausgerichtet, indem Ziele für die Neuausrichtung erstellt (RealignerTargetCreator) und eine Neuausrichtung durchgeführt wurden (IndelRealigner). Die Entfernung optischer Duplikate wurde mit Picard v2.10.1-SNAPSHOT (https://broadinstitute.github.io/picard/) abgeschlossen. Sequenzvarianten wurden mit Bcftools v1.9-80 (http://samtools.github.io/bcftools) aufgerufen, um für jedes Genom ein referenzbasiertes Pseudogenom mit einer Tiefe von mehr als dem 10-fachen zu generieren. Hochwertige Pseudogenome wurden verkettet (Plasmidsequenzen ausgenommen), bevor Gubbins v2.257 verwendet wurde, um rekombinante Regionen und unveränderliche Stellen zu entfernen. Vierzig aus der GenBank entnommene ST258-Genome (durch das Dreieck gekennzeichnet) wurden einbezogen, um die Wurzel des ST11-Baums zu etablieren. Das resultierende Mehrfachsequenz-Alignment referenzbasierter Pseudogenome (4460 Variantenstandorte) wurde verwendet, um unter Verwendung von RAxML-ng v0.6.068 mit 100 Bootstrap-Replikaten eine Phylogenie mit maximaler Wahrscheinlichkeit abzuleiten, um die Unterstützung zu bewerten.

Alle verfügbaren Genome von ST11 (n = 329) in der GenBank, die zum 1. März 2021 abgerufen wurden, wurden in diese Analyse einbezogen (Ergänzungsdatensatz 9). Snippy v4.6.0 (https://github.com/tseemann/snippy) wurde verwendet, um die 975 Genome am Referenzgenom KP16932 auszurichten und so die Ausrichtung der Kerngenom-SNPs zu generieren. SNPs in Rekombinationsregionen wurden von Gubbins v2.257 erkannt. Die resultierenden rekombinationsfreien Kerngenom-SNPs (3027 Variantenstellen) wurden verwendet, um unter Verwendung von RAxML-ng v0.6.068 mit einem GTR-Modell und Gammakorrektur auf eine Phylogenie mit maximaler Wahrscheinlichkeit zu schließen, und 100 Bootstrap-Replikationen wurden durchgeführt, um die Unterstützung zu bewerten. Mithilfe der bayesianischen phylogenetischen Inferenz wurde ein Chronogramm erstellt. Um die Rechenzeit zu verkürzen, wurden 147 Genome, einschließlich aller KLs, für die Analyse ausgewählt. Die Analyse zeitlicher molekularer Evolutionssignale für den Datensatz wurde mit TempEst v1.569 durchgeführt. Mit Snippy v4.6.0 wurde ein rekombinationsfreies Core-Genom-Alignment (1995 SNPs) erstellt. BEAST v1.10.470 wurde verwendet, um drei unabhängige Ketten mit einer Länge von 250.000.000 mit 10 % Burn-in zu erstellen und auszuführen, alle 25.000 zu protokollieren und invariante Sites zu berücksichtigen. Wir haben die vorherigen Annahmen eines koaleszierenden Bayes'schen Skyline-Modells für das Bevölkerungswachstum und einer entspannten logarithmischen Normaltaktrate einbezogen, um der Ratenheterogenität zwischen Zweigen Rechnung zu tragen. Die Konvergenz der Markov-Ketten-Monte-Carlo-Kette (MCMC) wurde in Tracer v1.7.271 überprüft, wobei alle Parameter-effektiven Stichprobengrößen >200 waren. Der Maximum Clade Credibility (MCC)-Baum unter jedem Modell wurde in TreeAnnotator generiert und in FigTree v1.4.4 (https://github.com/rambaut/figtree) dargestellt.

Rekombinationsgefilterte Kerngenom-SNPs jedes Datensatzes wurden wie oben beschrieben generiert, um die paarweisen SNP-Abstandsmatrizen zu berechnen. Für jedes Paar eindeutiger Patienten-Einrichtungs-Kombinationen wurde nur das am engsten verwandte Isolatpaar als paarweise genetische Distanz berücksichtigt. Hier wurde eine Reihe von Schwellenwerten verwendet, um aktuelle Übertragungspaare innerhalb und zwischen Einrichtungen anhand paarweiser Abstände zu identifizieren. Der Mindestschwellenwert wurde mit 14 SNPs (2 × 5.716.474 × 1,2256 × 10–6) unter Verwendung der Referenzgenomlänge (5.716.474 Basenpaare) und der Mutationsrate (1,2256 × 10–6 Mutationen pro Basenpaar und Jahr, geschätzt in dieser Studie) bestimmt Der maximale Schwellenwert wurde gemäß neueren Studien zur CRKP-Übertragung als 25 SNPs definiert7,16,17,18. Diese Analyse wurde mit dem Regentrans-Paket72 in R v4.1.1 durchgeführt.

Die Wilcoxon-Rangsummentests und Chi-Quadrat-Tests wurden für paarweise Gruppenvergleiche von MGEs, VFs, ARGs und dem Pearson-Koeffizienten durchgeführt. Die T-Tests der Schüler wurden für paarweise Gruppenvergleiche in phänotypischen Tests verwendet. Der Mann-Kendall-Test wurde verwendet, um Übertragungstrends zu testen. P-Werte <0,05 wurden als signifikant angesehen. Alle statistischen Analysen wurden in R v4.1.1 implementiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle zusammengestellten Illumina-Sequenzdaten wurden in der GenBank unter der BioProject-Zugangsnummer PRJNA778807 hinterlegt. Einzelne Zugangsnummern sind auch im Ergänzungsdatensatz 1 verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der in dieser Studie verwendete benutzerdefinierte Code ist unter https://github.com/xuechunxu/CRKP_ST11_KL64 (https://doi.org/10.5281/zenodo.7804081) frei verfügbar.

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Wir danken Jingjie Song und Yang Liu für ihre technische Unterstützung der Bioinformatik. Wir danken außerdem Jinru Ji und Chaoqun Ying für die Erstellung der Metadaten der Sammlung. Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China unter den Fördernummern 2021YFC2300300 (an KZ und YX) und 2022YFE0103200 (an KZ), der National Natural Science Foundation of China unter den Fördernummern 81902030 (an TX), 81971984 (an YX) finanziert. und 82172330 (an KZ), China Postdoctoral Science Foundation unter der Auszeichnungsnummer 2022M712187 (an C.-XX), Shenzhen Basic Research Key-Projekte unter der Auszeichnungsnummer JCYJ20200109144220704 (an KZ), Shenzhen Basic Research-Projekte unter der Auszeichnungsnummer JCYJ20190807144409307 (an KZ) , die Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten unter der Fördernummer 2022ZFJH003 (an YX) und das Forschungsprojekt des Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory unter der Fördernummer JNL-2022027C (an YX).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Kai Zhou, Chun-Xu Xue, Tingting Xu, Ping Shen.

Shenzhen Institute of Respiratory Diseases, Shenzhen People's Hospital (Second Clinical Medical College, Jinan University; The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology), Shenzhen, 518020, China

Kai Zhou, Chun-Xu Xue, Tingting Xu, Sha Wei und Jinquan Liu

Staatliches Schlüssellabor für Diagnose und Behandlung von Infektionskrankheiten, Nationales Klinisches Forschungszentrum für Infektionskrankheiten, Nationales Medizinisches Zentrum für Infektionskrankheiten, Kollaboratives Innovationszentrum für Diagnose und Behandlung von Infektionskrankheiten, Erstes angegliedertes Krankenhaus, Medizinische Fakultät der Zhejiang-Universität, Hangzhou, 310003, China

Ping Shen, Yunbo Chen und Yonghong Xiao

Abteilung für Infektionskrankheiten, Central Clinical School, Monash University, Melbourne, VIC, 3004, Australien

Kelly L. Wires, Margaret MC Lam und Kathryn E. Holt

Abteilung für klinisches Labor, Shenzhen People's Hospital, Shenzhen, China

Haoyun Lin

Abteilung für Infektionsbiologie, Fakultät für Infektions- und Tropenkrankheiten, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, WC1E 7HT, Großbritannien

Kathryn E. Holt

Das erste angegliederte Krankenhaus der Zhejiang-Universität, Hangzhou, China

Yunbo Chen

Zentralkrankenhaus der Stadt Lishui, Lishui, China

Hui Ding

Angegliedertes Krankenhaus des Binzhou Medical College, Binzhou, China

Yongyun Liu

das Erste Volkskrankenhaus von Lianyungang, Lianyungang, China

Haifeng Mao

Erstes angegliedertes Krankenhaus der Anhui Medical University, Hefei, China

Ying Huang

Yijishan-Krankenhaus dieser medizinischen Hochschule, Wuhu, China

Zhenghai Yang

Provinzkrankenhaus Anhui, Hefei, China

Yuanyuan Dai

Wuhan Puren Krankenhaus, Wuhan, China

Guolin Liao

Das Erste Volkskrankenhaus von Jingzhou, Jingzhou, China

Lisa Zhu

Volkskrankenhaus der Autonomen Region Ningxia der Hui, Yinchuan, China

Liping Zhang

Bezirkskrankenhaus Anyang der Provinz Henan, Anyang, China

Yanhong Li

Das Zweite Volkskrankenhaus der Provinz Yunnan, Kunming, China

Hongyun Xu

Provinzkrankenhaus für Traditionelle Chinesische Medizin Zhejiang, Hangzhou, China

Junmin Cao

Volkskrankenhaus der Stadt Huangshan, Huangshan, China

Baohua Zhang

Mindong-Krankenhaus der Stadt Ningde, Ningde, China

Liang Guo

Das angegliederte Krankenhaus der Jining Medical University, Jining, China

Haixin Dong

Volkskrankenhaus von Qingyang, Qingyang, China

Shuyan Hu

Volkskrankenhaus Tengzhou Center, Tengzhou, China

Sijin-Mann

Lu'an-Volkskrankenhaus, Lu′an, China

Lu Wang

Youyi-Krankenhaus der Uigurischen Autonomen Region Xinjiang, Urumqi, China

Zhixiang Liao

Volkskrankenhaus der Stadt Yichun, Yichun, China

Rong Xu

Erstes Volkskrankenhaus Jiujiang, Jiujiang, China

Dan Liu

Provinzkrankenhaus Shandong, Jinan, China

Yan Jin

Zentralkrankenhaus Jingzhou, Jingzhou, China

Yizheng Zhou

das erste angegliederte Krankenhaus der Gannan Medical University, Ganzhou, China

Yiqun Liao

Das erste Krankenhaus der Stadt Putian, Putian, China

Fenghong Chen

Volkskrankenhaus der Stadt Haining, Haining, China

Beiqing Gu

Shengli Oilfield Central Hospital, Dongying, China

Jiliang Wang

Das angegliederte Hongqi-Krankenhaus der Mudanjiang Medical College, Mudanjiang, China

Jinhua Liang

Das angegliederte Krankenhaus der Ningbo Medical School, Ningbo, China

Lin Zheng

Frauenkrankenhaus, Medizinische Fakultät der Zhejiang-Universität, Hangzhou, China

Aiyun Li

Das vierte angegliederte Krankenhaus der Anhui Medical University, Hefei, China

Jilu Shen

Volkskrankenhaus der Stadt Tianchang, Chuzhou, China

Yinqiao Dong

Volkskrankenhaus der Provinz Shanxi, Taiyuan, China

Lixia Zhang

Das erste angegliederte Krankenhaus der Henan University of Science and Technology, Luoyang, China

Hongxia Hu

Das Zweite Volkskrankenhaus von Jingzhou, Jingzhou, China

Bo Quan

Zivilkrankenhaus Lu'an, Lu′an, China

Wencheng Zhu

Das zweite angegliederte Krankenhaus des Bengbu Medicine College, Bengbu, China

Kunpeng Liang

Huaihe-Krankenhaus der Henan-Universität, Kaifeng, China

Qiang Liu

Qilu-Kinderkrankenhaus der Shandong-Universität, Jinan, China

Shifu Wang

Drittes Volkskrankenhaus Zigong, Zigong, China

Xiaoping Yan

das Zweite Krankenhaus der Shanxi Medical University, Taiyuan, China

Jiangbang Kang

das Volkskrankenhaus von Lujiang, Hefei, China

Xiusan Xia

das Erste Volkskrankenhaus von Jiayuguan, Jiayuguan, China

Lan Ma

Das Dritte Krankenhaus von Hefei, Hefei, China

Li Sun

Allgemeines Krankenhaus des Northern Theatre Command, Shenyang, China

Liang Luan

Xingang-Krankenhaus von Xinyu, Xinyu, China

Jianzhong Wang

Volkskrankenhaus Shenzhen, Shenzhen, China

Haoyun Lin

Das erste angegliederte Krankenhaus der Medizinischen Universität Xi'an, Xi'an, China

Zhuo Li

Provinzkrankenhaus für Traditionelle Chinesische Medizin Gansu, Lanzhou, China

Dengyan Qiao

Erstes Volkskrankenhaus von Chenzhou, Chenzhou, China

Lin Zhang

Changshu Medicine Examination Institute, Changshu, China

Chuandan Wan

Frauen- und Kinderkrankenhaus des Bezirks Jin'an, Lu′an, China

Xiaoyan Qi

Hubin-Krankenhaus von Hefei, Hefei, China

Fei Du

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KZ, YX und KEH konzipierten das Projekt und überarbeiteten das Manuskript. Die BRICS-Arbeitsgruppe sammelte die Bakterienisolate und epidemiologischen Daten und führte vorläufige Laboranalysen durch. KZ, C.-XX, PS, YC, KLW und MMCL führten die Datenanalyse durch. TX, SW, JL, HL und PS führten die Experimente durch. KZ hat das Manuskript geschrieben. KZ und YX sind der Garant dieser Arbeit und hatten als solche vollen Zugriff auf alle Daten der Studie und übernehmen die Verantwortung für die Integrität der Daten und die Genauigkeit der Datenanalyse. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Kai Zhou oder Yonghong Xiao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhou, K., Xue, CX., Xu, T. et al. Eine Punktmutation in recC, die mit dem subklonalen Ersatz von Carbapenem-resistentem Klebsiella pneumoniae ST11 in China verbunden ist. Nat Commun 14, 2464 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38061-z

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Eingegangen: 26. Dezember 2022

Angenommen: 13. April 2023

Veröffentlicht: 28. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38061-z

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