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May 30, 2023

Eine Längsschnittanalyse der heißen Quellen der Five Sisters im Yellowstone-Nationalpark zeigt eine dynamische thermoalkalische Umgebung

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 18707 (2022) Diesen Artikel zitieren 1369 Zugriffe 2 Altmetric Metrics Details Die Forschung konzentrierte sich auf mikrobielle Populationen thermoalkalischer Quellen

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18707 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Forschung, die sich auf mikrobielle Populationen thermoalkalischer Quellen konzentriert, wurde zu einem großen Teil durch die Verlockung vorangetrieben, funktionelle Enzyme mit industriellen Anwendungen in Umgebungen mit hohem pH-Wert und hohen Temperaturen zu entdecken. Während sich mehrere Studien auf das Verständnis der grundlegenden Ökologie dieser Quellen konzentrierten, wurden die kleinen Molekülprofile thermoalkalischer Quellen weitgehend übersehen. Um besser zu verstehen, wie Geochemie, Zusammensetzung kleiner Moleküle und mikrobielle Gemeinschaften zusammenhängen, führten wir eine dreijährige Studie der Quellen der Five Sisters (FS) durch, die hochauflösende geochemische Messungen, 16S-rRNA-Sequenzierung der Bakterien- und Archaeengemeinschaft usw. umfasste Massenspektrometriebasierte Charakterisierung von Metaboliten und extrazellulären kleinen Molekülen. Die Integration der vier Datensätze ermöglichte eine umfassende Analyse des verflochtenen thermoalkalischen Federsystems. Im Verlauf der Studie reagierte die Mikrobenpopulation auf veränderte Umweltbedingungen, wobei die relative Häufigkeit und Diversität der Archaeenpopulationen im Vergleich zu den Bakterienpopulationen abnahm. Ein Rückgang der relativen Häufigkeit von Archaeen war mit Umweltveränderungen verbunden, zu denen eine verringerte Verfügbarkeit spezifischer stickstoff- und schwefelhaltiger extrazellulärer kleiner Moleküle und Schwankungen der Stoffwechselwege im Zusammenhang mit dem Stickstoffkreislauf gehörten. Diese multifaktorielle Analyse zeigt, dass die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft enger mit Pools extrazellulärer kleiner Moleküle korreliert als mit der Geochemie der Thermalquellen. Dies ist ein neuartiger Befund und legt nahe, dass eine bisher übersehene Komponente von Thermalquellen einen erheblichen Einfluss auf die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft haben könnte.

Thermoalkalische Quellen sind einzigartige Lebensräume von biologischer und industrieller Bedeutung. Kommerzielle Anwendungen dieser Systeme sind gut dokumentiert und die aktuellen Bemühungen zur thermoalkalischen Bioprospektion sind breit gefächert1. Ein erfolgreiches Beispiel ist die Kommerzialisierung einer Reihe thermostabiler Enzyme, darunter lipolytische und hydrolytische Enzyme2,3. Von besonderem Interesse ist die Entwicklung thermostabiler cellulolytischer Enzyme, die unter industriellen Bedingungen lignocellulosehaltige Biomasse in Zucker und letztendlich Ethanol umwandeln können4. Das Potenzial zur Entwicklung thermo- und pH-stabiler Enzyme für kommerzielle Anwendungen und das Interesse an der Ökologie dieser Systeme haben zu einer Anhäufung geochemischer und mikrobieller phylogenetischer Daten geführt5,6,7,8.

Neben den Bemühungen zur Bioprospektion hat auch die thermoalkalische Ökologie die Forschung vorangetrieben. Durch diese Arbeit wurde gezeigt, dass die Temperatur ein großer Faktor für die mikrobielle Vielfalt ist, wobei steigende Frühlingstemperaturen zu einem Rückgang der mikrobiellen Vielfalt führen9,10,11. Temperaturanstiege wurden auch mit einer Zunahme der Häufigkeit und Diversität der Archaeen in Verbindung gebracht11,12. Es hat sich gezeigt, dass Thermophile einen weiten pH-Bereich von 10,13 tolerieren. Es hat sich auch gezeigt, dass der pH-Wert ein wichtiger Faktor für die Häufigkeit und Vielfalt in thermischen Umgebungen ist, wobei zirkumneutrale und alkalische Quellen vielfältigere mikrobielle Populationen begünstigen13,14. Diese beiden Faktoren allein erklären jedoch nicht vollständig die Ansammlung mikrobieller Populationen in thermischen Systemen15. Es wurde gezeigt, dass thermoalkalische Quellen eine Vielzahl von Bakterien und Archaeen enthalten, wobei mehrere häufig vorkommende Gruppen in Quellen mit unterschiedlicher Geochemie und geografischer Lage leben9,16. Zu den vorherrschenden Mikroben in den beschriebenen Quellen gehören Chloroflexi, Deinococcus, Nitrospiral, Cyanobacteria, Proteobacteria, Thermodesulfobacteria, Aquificae, Thermotague, Thermococcales und Crenarchaeota9,14,16,17.

Trotz des zunehmenden Interesses und der zunehmenden Forschung an diesen Systemen bestehen weiterhin Wissenslücken2. Beispielsweise wurde die zeitliche Dynamik thermoalkalischer Mikrobenpopulationen über mehrere Jahre hinweg selten untersucht17,18,19 und unseres Wissens wurden keine Analysen durchgeführt, die das mikrobielle mit dem intrazellulären Metabolom und der extrazellulären Zusammensetzung kleiner Moleküle kombinieren. Dies gilt insbesondere für die Probenahme heißer Quellen im YNP im Winter, wo der Zugang begrenzt ist. Zu den Herausforderungen, die mit der Erweiterung des Wissens über thermoalkalische Quellen verbunden sind, gehört die mikrobielle Kultivierung. Um das spezifische Stoffwechselpotenzial und die ökologischen Beiträge einzelner Mikroben zu bestätigen, sind häufig kultivierte Isolate erforderlich. Extreme Umgebungen wie thermoalkalische Quellen haben die Isolationsbemühungen bei der Anwendung traditioneller Kultivierungspraktiken vor Herausforderungen gestellt, insbesondere im Hinblick auf Archaeen16,20. Der Gewinn eines extrazellulären und intrazellulären Verständnisses thermoalkalischer Umgebungen hat weitreichende Auswirkungen, einschließlich der Verbesserung der Kultivierungsbemühungen durch die Bereitstellung von Einblicken in die Umgebung kleiner Moleküle und Stoffwechselnetzwerke.

Thermoalkalische Quellen gibt es an mehreren Orten auf der ganzen Welt, unter anderem im Yellowstone-Nationalpark (YNP), wo sie weit verbreitet sind1,21,22. Zu einer solchen Gruppe von Quellen in YNP gehören die heißen Quellen Five Sisters (FS), die sich im White Creek Drainage (WCD) befinden. WCD ist Teil des Lower Geyser Basin, dem größten Thermalbecken im YNP. Thermische Merkmale in WCD wurden bereits zuvor als Bereiche identifiziert, die wahrscheinlich unterschiedliche und dynamische Umgebungen enthalten23,24. Das FS-System beherbergt eine Vielzahl von Stoffwechselaktivitäten, wobei die Photosynthese im Frühjahr und Sommer an den Rändern der kühleren Becken stattfindet und heterotrophe Aktivitäten durch den Abbau von Lignozellulose6 angetrieben werden. In dieser Studie wurden die thermoalkalischen FS-Quellen über einen Zeitraum von drei Jahren untersucht und eine umfassende Analyse mithilfe hochauflösender geochemischer Messungen, 16S-rRNA-Sequenzierung der mikrobiellen Gemeinschaft und einer auf Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LCMS) basierenden Charakterisierung kleiner Moleküle durchgeführt, die dies ermöglichte Ermittlung zeitlicher mikrobieller Trends und ein besseres Verständnis der treibenden Faktoren, die Veränderungen in der Zusammensetzung und im Stoffwechsel der Mikrobenpopulation in dieser einzigartigen Umgebung zugrunde liegen.

Um die Ökologie thermoalkalischer Quellen vollständig zu dokumentieren, haben wir eine umfassende Analyse des FS-Quellensystems im Yellowstone-Nationalpark durchgeführt (Abb. 1a). Dieser einzigartige Standort besteht aus fünf thermoalkalischen Pools, die von Ost nach West mit 1 bis 5 gekennzeichnet sind und variable Verbindungen aufweisen (Abb. 1b). Drei Jahre lang wurden zur gleichen Jahreszeit Proben gesammelt und geochemische, 16S-rRNA- und kleine Moleküldaten gesammelt. Wir begannen unsere Analyse mit der Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft und konzentrierten uns dabei auf Populationen, die zeitliche Variationen zeigten. Dies zeigte mehrere mikrobielle Muster, darunter zwei auffällige Trends in der relativen Häufigkeit (Abb. 2a). Erstens wurde von 2017 bis 2018 und von 2018 bis 2019 ein stetiger Rückgang der relativen Häufigkeit mikrobieller ZOTUs aus dem Superphylum TACK beobachtet. Zweitens war ein Anstieg der relativen Häufigkeit von ZOTUs aus den Bakterienstämmen Proteobacteria und Deinococcota zu beobachten. Im Verlauf der Studie verzeichneten FS1 und FS5 einen deutlichen Anstieg der relativen Häufigkeit von Deinococcota, während FS2, FS3 und FS4 im Jahr 2019 einen relativen Anstieg der Proteobakterienpopulation verzeichneten (Abb. 2b). Andere Trends, wie etwa ein relativer Rückgang der Acidobacteriota-Populationen in FS3, FS4 und FS5 von 2017 bis 2019, waren ebenfalls erkennbar. Zusammen mit einem deutlichen Rückgang der Häufigkeit verringerte sich die Alpha-Diversität der Archaeen für jedes Frühjahr zwischen 2017 und 2019 anhand eines Shannon-Index (Abb. 3). Die Ausnahme von diesem Muster war FS5, das im Jahr 2019 einen Anstieg der Alpha-Diversität aufwies. Obwohl die archaische Alpha-Diversität mit ~ 1,2 für die FS-Quellen leicht niedrig war, war sie ähnlich wie frühere Studien11,25. Die 16S-rRNA-Analyse zeigte eine vielfältige und elastische mikrobielle Gemeinschaft sowie einen stetigen Rückgang der archaischen Diversität von 2017 bis 2019.

Die Probenahme erfolgte am Five Sisters-Quellensystem im White Creek Drainage in YNP. (a) Karte von YNP mit Angabe der Lage der Five Sisters-Quellen nördlich von Old Faithful, erstellt mit Adobe Illustrator vCC, adobe.com. (b) Bild der Quellen der Five Sisters mit allen fünf Becken beschriftet.

Die relative Mikrobenhäufigkeit wurde für jedes Frühjahr von 2017 bis 2019 bestimmt. (a) Relative Häufigkeit jedes Frühjahrs auf Stammebene auf Jahresbasis. Die Zusammensetzung der Mikrobenpopulation ändert sich im Laufe des Dreijahreszeitraums. Jedes Feld repräsentiert ein Jahr von 2017 bis 2019 mit den relativen Häufigkeitsniveaus der Quellen FS1–FS5. (b) Abundanz auf Phylum-Ebene über die Jahre hinweg für jede der Five Sisters-Quellen.

Die mikrobielle Alpha-Diversität wurde jedes Jahr anhand eines Shannon-Index für alle Quellen berechnet. (a) Bakterien-Alpha-Diversität von 2017 bis 2019. (b) Archaeen-Alpha-Diversität von 2017 bis 2019. Die Shannon-Index-Analyse berücksichtigt sowohl die Gleichmäßigkeit als auch den Reichtum in einem System.

Anschließend wurden die geochemischen und niedermolekularen Datensätze untersucht, um mögliche Ursachen für den zeitlichen und linearen Rückgang der Archaeenpopulation zu ermitteln. Wir untersuchten zunächst die geochemischen Daten und eine erste Analyse zeigte, wie konsistent jede Quelle im Verlauf der Studie war (Tabelle 1). Temperatur und pH-Wert unterschieden sich zwischen den Jahren nicht wesentlich, und andere häufig erfasste geochemische Variablen wie der Gesamtkohlenstoff zeigten kaum Veränderungen. Die Analyse mithilfe eines zweidimensionalen Ergebnisdiagramms der Hauptkomponentenanalyse (2D-PCA) verdeutlichte den Trend einer ähnlichen Geochemie in den Jahren 2017, 2018 und 2019 (Abb. 4a). Die jährlichen geochemischen Schwankungen schienen moderat zu sein, obwohl vier geochemische Messungen, darunter Stickstoff-, Natrium-, Sulfat- und Zinkkonzentrationen, mithilfe einer ANOVA-Analyse (p <0,05) zwischen den drei Jahren signifikant unterschiedlich waren (p <0,05) (Abb. 4b). Allerdings waren die Muster der Konzentrationsänderungen zwischen 2017 und 2019 für diese Variablen nicht linear. Die Gesamtstickstoffkonzentrationen sanken im Jahr 2018 und stiegen dann im Jahr 2019 wieder auf das Niveau von 2017 (Abb. 4b). Sowohl Natrium als auch Zink stiegen 2019 im Vergleich zu 2017 an, blieben jedoch zwischen 2017 und 2018 für Natrium und 2018 und 2019 für Zink konstant. Die Sulfatkonzentrationen zeigten ein weiteres separates Muster: Sie stiegen im Jahr 2018 an und sanken dann im Jahr 2019 auf unter die Werte von 2017. Obwohl nicht in der PCA- oder ANOVA-Analyse enthalten, zeigt Tabelle 1 auch, dass die Schneedecke, die letztendlich in Frühjahrsabfluss übergeht, zwischen den Jahren unterschiedlich war. Die Schneewasseräquivalente (SWE) lagen 2016 leicht unter dem Durchschnitt, während sie 2017 und 2018 höher als normal waren, wobei 2018 höhere SWE als 2017 auftraten. Die Menge an SWE bestimmt die Menge des Abflusses im folgenden Jahr, d. h. die SWE 2016 würde sich auf das Frühjahr auswirken Abfluss und Probenentnahme im Winter 2017. Die geochemische Analyse der thermischen Umgebung zeigte im Laufe der drei Jahre ein ziemlich homogenes System, ohne dass sich ein klares Muster abzeichnete, außer einem stetigen linearen Anstieg der jährlichen Schneedecke von 2016 bis 2018.

Bei jeder Probenahme wurde eine geochemische Analyse durchgeführt. (a) 2D-PCA-Bewertungsdiagramm aller fünf Quellen pro Jahr. Schattierte Bereiche geben 95 %-Konfidenzintervalle an. (b) Einfaktorielle parametrische ANOVA-Analyse, die geochemische Merkmale anzeigt, deren Niveaus sich zwischen den drei Jahren signifikant unterscheiden (p-Wert < 0,05).

Da die geochemischen Ergebnisse keine wahrscheinlichen Faktoren lieferten, die den in den 16S-rRNA-Daten beobachteten Rückgang der relativen Häufigkeit der Archaeen erklären könnten, bestand unser nächster Schritt darin, mikrobielle intrazelluläre kleine Moleküle mittels LC-MS zu charakterisieren. Eine Analyse intrazellulärer kleiner Moleküle, die aus Zellpellets extrahiert wurden, deutete darauf hin, dass ein Stoffwechselübergang stattgefunden hatte. Ein 2D-PCA-Score-Diagramm der globalen Stoffwechselprofile kleiner Moleküle für jedes Jahr zeigte einen Kontrast in der Stoffwechselaktivität zwischen 2017 und 2018 und 2019 (Abb. 5a). Intrazelluläre kleine Moleküle aus den Jahren 2018 und 2019 zeigten einige Unterschiede, waren jedoch enger verwandt als die aus dem Jahr 2017. Eine funktionelle Untersuchung der metabolomischen Profile begann mit der Identifizierung von Metaboliten mithilfe einer Kombination aus authentischen Standards und MSMS-Techniken. Anschließend wurde eine ANOVA-Analyse zum Screening der identifizierten Metaboliten verwendet, was zu einer Liste von 77 spezifischen Metaboliten führte, die anhand ihrer Häufigkeit die Jahre 2017, 2018 und 2019 unterscheiden konnten (p < 0,05) (Ergänzungstabelle 1). Um die identifizierten Metaboliten weiter zu untersuchen, wurde eine Heatmap erstellt, die ähnliche Profile zwischen 2018 und 2019 im Vergleich zu 2017 anzeigte (Abb. 5b). Abschließend wurde eine Signalweganalyse unter Verwendung der signifikanten Metaboliten und ihrer relativen Konzentrationen durchgeführt. Dies ergab 16 Pfade mit einem Holms-korrigierten p-Wert < 0,05 (Tabelle 2). Der Einfluss der identifizierten Metaboliten in jedem Signalweg wurde auch mithilfe von MetPA bestimmt (Abb. 5c). Diese objektive Analyse der hervorgehobenen Pfade ergab 5 signifikante (p < 0,05) und wirkungsvolle (Impact Score > 0,1) Pfade: Pyrimidin-Metabolismus, Glutamat- und Glutamin-Metabolismus, Arginin- und Prolin-Metabolismus, Riboflavin-Metabolismus und der Citratzyklus (TCA).

Intrazelluläre kleine Moleküle wurden isoliert und metabolische Profile analysiert. (a) PCA der intrazellulären kleinen Moleküle. Metaboliten aus 2017 gruppieren sich getrennt von 2018 und 2019. Metaboliten aus 2018 und 2019 gruppieren sich unabhängig voneinander, überlappen sich jedoch in den 95 %-Konfidenzintervallen für mehrere Quellen, am stärksten in FS4 und FS5. (b) Heatmap der signifikanten identifizierten Metaboliten zwischen den Jahren, ermittelt mit einer ANOVA (p < 0,05). Das Probenahmejahr ist oben in der Abbildung angegeben, wobei jede Spalte eine Probe und jede Zeile einen identifizierten Metaboliten darstellt. Das Dendrogramm an der Spitze gruppiert 2018 und 2019 getrennt von 2017, basierend auf der relativen Häufigkeit der identifizierten Metaboliten. Die Abbildung wurde mit MetaboAnalyst v4.0 erstellt. (c) Von den identifizierten Metaboliten abgeleitete Stoffwechselwege, wobei die y-Achse den p-Wert aus einer ANOVA der Gruppen und die x-Achse die metabolische Auswirkung basierend auf den identifizierten Metaboliten zeigt ihre Rolle im spezifischen Stoffwechselweg.

Aus dem Sediment extrahierte extrazelluläre kleine Moleküle zeigten einen ähnlichen Trend, wobei sich 2017 deutlich von 2018 und 2019 unterschied (Abb. 6a). Die Variation zwischen den Jahren war in den Sedimentumgebungen 2017 FS1 und FS5 am deutlichsten. Aufgrund der einzigartigen molekularen Zusammensetzung des extrazellulären Profils kleiner Moleküle wurden eher chemische Formeln als Identifizierungen bestimmt. Die Untersuchung chemischer Formeln für die 50 wichtigsten kleinen Moleküle, die die Jahre am besten unterscheiden, anhand einer Heatmap zeigte, dass sich die Häufigkeit bestimmter elementarer stickstoff- und schwefelhaltiger Arten im Frühlingssediment von 2017 im Vergleich zu 2018 und 2019 verändert hat (Abb. 6b). Von den 50 am besten diskriminierenden kleinen Molekülen basierend auf einer ANOVA enthielten nur zwei weder Stickstoff noch Schwefel. Dies führte zu einer Untersuchung stickstoff- und schwefelhaltiger Spezies in den Profilen kleiner Moleküle und einem allgemeinen Trend, der darauf hindeutet, dass die Anzahl einzigartiger stickstoff-, schwefelhaltiger und kombinierter stickstoff- und schwefelhaltiger Verbindungen in den thermischen Sedimenten jedes Jahr abnimmt der Studie (Abb. 6c). Stickstoffhaltige Verbindungen verzeichneten zwischen 2017 und 2019 einen Rückgang um 15 %, während schwefelhaltige Verbindungen im gleichen Zeitraum einen Rückgang um 30 % verzeichneten. Die durch Massenspektrometrie generierten Daten zu kleinen Molekülen enthielten eine Fülle von Informationen, aus denen ein konsistenter Trend hervorging, bei dem die Anzahl einzigartiger extrazellulärer stickstoff- und schwefelhaltiger kleiner Moleküle im FS-System jedes Jahr abnahm.

Extrazelluläre kleine Moleküle wurden isoliert und die Profile kleiner Moleküle analysiert. (a) PCA für extrazelluläre kleine Moleküle im Sediment. Die Gruppen 2018 und 2019 liegen im Vergleich zu 2017 sehr nahe beieinander. FS2-4 aus dem Jahr 2017 gruppieren sich zusammen und liegen näher an 2018 und 2019 als FS1 und FS5 aus dem Jahr 2017. (b) Heatmap der 50 am stärksten diskriminierenden kleinen Moleküle zwischen 2017, 2018 und 2019. Der obere Teil der Abbildung zeigt das Jahr jeder Probe mit einem Dendrogramm, das angibt, dass 2017 unabhängig von 2018 und 2019 gruppiert ist. Die Abbildung wurde mit MetaboAnalyst v4.0 erstellt. (c) Diagramm, das einzigartige Schwefel-, Stickstoff- und Schwefel- und stickstoffhaltige Moleküle zeigt. Elementspezifische Moleküle werden in jedem Jahr von 2017 bis 2019 angezeigt. Die Formeln wurden aus den Massenspektrometrie-Datensätzen mit einem Fehler von 15 ppm ermittelt.

Korrelogramme wurden erstellt, um festzustellen, ob statistisch wichtige Variablen in den 16S-rRNA-Daten mit Variablen aus den drei entsprechenden zeitlichen Datensätzen korrelierten. Korrelogramme wurden verwendet, um eine Begründung für die möglichen Mechanismen des archaischen Rückgangs in den FS-Quellen im Laufe der Zeit zu liefern. Die zehn am stärksten diskriminierenden Variablen zwischen Jahr und Frühling wurden aus dem geochemischen Datensatz ausgewählt und mit 16S-rRNA-Sequenzierungsinformationen korreliert (ergänzende Abbildung 1). Diese Abbildung wurde mithilfe von ZOTUs erstellt, wird jedoch in phylogenetischer Reihenfolge angezeigt. Sieben von zehn bakteriellen und archaealen ZOTUs zeigten eine signifikante positive Korrelation mit den Sulfatkonzentrationen (ergänzende Abbildung 1). Zinkkonzentrationen waren in ähnlicher Weise mit einem Anstieg der zehn wichtigsten mikrobiellen Variablen verbunden, obwohl dieser Trend nicht so ausgeprägt war wie bei Sulfat. Natrium, Arsen und gelöster Sauerstoff zeigten einen gegenläufigen Trend mit einer negativen Korrelation mit den meisten der ausgewählten ZOTUs.

Eine weitere korrelative Analyse der Datensätze kleiner Moleküle ergab starke Beziehungen zwischen bestimmten stickstoff- und schwefelhaltigen Verbindungen und Archaeen, von denen die meisten überwiegend positiv waren (Abb. 7). Nicht nur waren fast alle Korrelationen positiv, d. h. es wurden Abnahmen spezifischer kleiner Moleküle beobachtet, die mit einer Abnahme der relativen Häufigkeit der Archaeen einhergingen, sondern die Mehrheit der Korrelationen war auch signifikant mit einem p-Wert < 0,05. Ein archaeischer phylogenetischer Baum mit den 25 wichtigsten ZOTUs zwischen Jahren, die positive Korrelationen zu den jährlichen Konzentrationen stickstoff- und/oder schwefelhaltiger Verbindungen aufwiesen, zeigte, dass die ZOTUs mit signifikanten Korrelationen zu zwei getrennten Gruppen von Archaea gehörten, den Phyla Aigarchaeota und Crenarchaeota im TACK-Superphylum (Abb. 8)22. Diese Analyse zeigte eine Beziehung zwischen spezifischen stickstoff- und schwefelhaltigen extrazellulären kleinen Molekülen und verschiedenen Gruppen von Aigarchaeota und Crenarchaeota.

Daten aus allen verfügbaren Datensätzen wurden untersucht, um korrelative Merkmale zu bestimmen. (a) Korrelogramm, wie im Abschnitt „Methoden“ zur Untersuchung archaischer ZOTUs und schwefelhaltiger extrazellulärer kleiner Moleküle beschrieben. (b) Korrelogramm von archaealen ZOTUs und stickstoffhaltigen extrazellulären kleinen Molekülen. Die Intensität der Farbe gibt die Stärke der Korrelation an, wobei Blau positive und Rot negative Korrelationen anzeigt. Ein Sternchen zeigt einen p-Wert von < 0,05 für die Korrelation an. Korrelogramme wurden mit dem mixOmics-Paket in R erstellt.

Es wurde ein phylogenetischer Baum archaischer Sequenzen erstellt und im Baum ZOTUs identifiziert, die stark mit den Datensätzen extrazellulärer kleiner Moleküle korrelierten. Der innere Ring wird von Archaeen bevölkert, die mithilfe metagenomischer Daten in der Five Sisters-Stätte gefunden wurden. Die farbigen Formen im inneren Ring weisen auf Stämme zuvor kultivierter und charakterisierter Archaeenarten hin, die den gezeigten taxonomischen Klassifikationen entsprechen. In der Korrelogrammanalyse isolierte archaische Sequenzen werden durch rote Striche im äußeren Ring angezeigt. Die Figur wurde mit Interactive Tree of Life v6 erstellt.

Diese Studie wurde durchgeführt, um thermoalkalische heiße Quellen und das mikrobielle Leben, das sie bewohnt, zu erforschen, um die Ökologie und Biologie kleiner Moleküle dieser einzigartigen Umgebungen besser zu verstehen. Die beschriebene Analyse ermöglichte den bisher umfassendsten Einblick in das mikrobielle Leben im FS-Quellensystem. Unsere Daten deuten darauf hin, dass zwischen 2017 und 2018 wahrscheinlich eine systemische Veränderung stattgefunden hat, die sich erheblich auf die Umwelt und die mikrobielle Ökologie der FS-Quellen ausgewirkt hat. Proben aus den Jahren 2017 bis 2018 zeigten koordinierte Verschiebungen extrazellulärer kleiner Moleküle, mikrobieller und intrazellulärer kleiner Moleküle. Diese allgemeinen Trends erklärten jedoch nicht vollständig das Muster des Rückgangs der Archaeen im Vergleich zu dem der Bakterienpopulationen. Dieses Phänomen unterschiedlicher Reaktionen zwischen Bakterien und Archaeen auf einen gemeinsamen Umweltreiz wurde von Pala et al. beobachtet, wobei gegensätzliche Verschiebungen der Archaeen- und Bakterienhäufigkeit das Ergebnis unterschiedlicher geochemischer Faktoren in derselben wässrigen Umgebung waren26.

Die geochemischen Variablen mit signifikanten Unterschieden im Verlauf der Studie zeigten jedoch kein charakteristisches Muster, das die Daten zur Archaeenpopulation widerspiegelte. Um ein korrelatives Muster für den Rückgang der Archaeen zu entdecken, untersuchten wir anschließend die intrazellulären und extrazellulären Profile kleiner Moleküle. Eine erste Untersuchung ergab eine globale Verschiebung zwischen 2017 und 2018, was auf Umwelt- und Stoffwechselveränderungen in den mikrobiellen Gemeinschaften des Quellsystems in diesem Zeitraum schließen lässt. Eine genauere Untersuchung der intrazellulären Daten ergab eine Störung mehrerer spezifischer Stickstoff- und Schwefelkreislaufwege. Zu den Signalwegen, die sich als wirkungsvoll und bedeutsam erwiesen haben, gehörten der Pyrimidin-Metabolismus, der Glutamat- und Glutamin-Metabolismus, der Arginin- und Prolin-Metabolismus, der Riboflavin-Metabolismus und der Citratzyklus. Diese Wege haben alle Verbindungen sowohl zum Energiestoffwechsel und Stickstoffkreislauf als auch zu anderen metabolischen Auswirkungen27,28. Eine Störung der Häufigkeit von Metaboliten in diesen Signalwegen könnte auf Verschiebungen in der Häufigkeit von Archaeen zurückzuführen sein oder diese verursachen, insbesondere bei Signalwegen, die sich auf den Stickstoffkreislauf auswirken, wo Archaeen nachweislich eine Schlüsselrolle spielen29. Insbesondere verfügen Archaeen über einzigartige Enzyme und Wege in der Riboflavinsynthese sowie in den Stickstoffassimilations- und -dissimilationswegen, die den Aminosäurestoffwechsel sowie den Pyrimidinstoffwechsel und den Citratzyklus modulieren könnten30,31. Obwohl der Sulfatstoffwechsel in unserem MetPA nicht als ausschlaggebend eingestuft wurde, wurde auch festgestellt, dass er zwischen den Jahren signifikant (p < 0,05) fehlreguliert ist und es bekannt ist, dass es unterschiedliche Enzyme und Wege zwischen dem Stoffwechsel von Bakterien und Archaeen gibt32.

Während die erste Analyse intrazellulärer und extrazellulärer kleiner Moleküle eine Verschiebung des Stoffwechsels und der Frühlingsumgebung zwischen 2017 und 2018 zeigte, konnte sie den anhaltenden Rückgang der Archaeen zwischen 2017 und 2019 nicht vollständig erklären. Unsere Analyse zeigt, dass die stärksten Korrelationen mit dem Rückgang der Archaeen bestehen auf bestimmte stickstoff- und schwefelhaltige kleine Moleküle. Diese kleinen Moleküle gingen von 2017 bis 2019 stetig zurück und fielen mit einem allgemeinen Rückgang der relativen Häufigkeit und Vielfalt der Archaeen zusammen. Diese Beobachtung führte zu der Hypothese, dass Umweltveränderungen unterschiedliche Profile kleiner Moleküle mit unterschiedlicher Elementzusammensetzung und -struktur hervorrufen könnten, was dazu führen könnte, dass Thermophile im FS-System ihre Stoffwechselstrategien an Umweltveränderungen anpassen. Die Verfügbarkeit bioaktiver kleiner Moleküle würde dann zu einem unterschiedlichen Erfolg bestimmter Organismen im FS-System führen, was die Verschiebung der Bevölkerungszusammensetzung von 2017 bis 2019 erklären könnte, die durch die Beobachtung eines Rückgangs der relativen Häufigkeit von Archaeen definiert wurde.

Obwohl ein allgemeiner Rückgang der Archaeen festgestellt wurde, zeigten zwei Gruppen von Archaeen eine starke positive Korrelation mit der Anzahl der nachgewiesenen Stickstoff- und Schwefelverbindungen. Diese Archaeen gehörten entweder zu Aigarchaeota oder Crenarchaeota, beides Mitglieder des TACK-Superphylums33. Die am höchsten korrelierenden Archaea umfassten keine Mitglieder der anderen Superphyla DPANN, Euryarchaeota oder Asgard34. Viele Mitglieder der TACK-Klade haben eine starke funktionelle Rolle in Stickstoff- und Schwefelkreisläufen gezeigt, wie z. B. Ammoniakoxidation (Thaumarchaeota), Schwefeloxidation (Crenarchaeota), unterschiedlicher Schwefelstoffwechsel (Korarchaeota) und fakultative Nitratreduktion (Geoarchaeota)1,29,35, 36. Die Korrelationen zu stickstoff- und schwefelhaltigen Verbindungen in Verbindung mit zuvor entdeckten Stoffwechselmerkmalen des TACK-Superphylums zeigen die Notwendigkeit, die Beziehung, die zwischen den Arten von Aigarchaeota und Crenarchaeota im FS-System in Bezug auf den Stickstoff- und Schwefelstoffwechsel bestehen könnte, weiter zu untersuchen. Insbesondere die weltweit verbreiteten, aber noch nicht kultivierten Aigarchaeota37 wurden durchweg in hoher relativer Häufigkeit an thermoalkalischen Standorten im Yellowstone gefunden17,38. Basierend auf Metagenomik und Einzelzellanordnungen weist diese Gruppe eine hohe metabolische Vielseitigkeit auf, einschließlich der Wege Autotrophie, Dissimilaritätssulfitreduktion und Kohlenmonoxidoxidation39, sowie Diversität bei der Nutzung von Kohlenstoffsubstraten, einschließlich Acetat, Fettsäuren und Aminosäuren40, die eine große Rolle spielen könnten Rolle im Nährstoffkreislauf in diesen Systemen.

Während der Rückgang stickstoff- und schwefelhaltiger extrazellulärer kleiner Moleküle auf abiotische oder biotische Einflüsse zurückzuführen sein könnte, haben Gonisor et al. kamen zu dem Schluss, dass die im nahegelegenen Octopus Spring beobachtete Chemodiversität wahrscheinlich nicht mikrobiell bedingt war41. Ihre Interpretation basierte auf der geringen Artenvielfalt thermoalkalischer Quellen und dem hohen Anteil einzigartiger extrazellulärer kleiner Moleküle. Eine mögliche Erklärung für den Verlust von Stickstoff- und Schwefelverbindungen ist die unterschiedliche jährliche Vermischung von Grund- und Oberflächenwasser in den Quellen, wo Abfluss, Grundwasser und Schneedecke die Geochemie der Quelle und die Zusammensetzung extrazellulärer kleiner Moleküle beeinflussen können41,42. In unserer Studie wurden Ende Februar und Anfang März Proben entnommen. Unsere Probenahmen fallen mit einem sehr geringen Oberflächenabfluss zusammen, der im späten Frühjahr an diesem Standort auftritt. Die durchschnittliche Umgebungstemperatur während unserer Probenahmezeit lag immer noch deutlich unter dem Gefrierpunkt, sodass kein nennenswertes zusätzliches Schmelzen stattgefunden haben sollte, so dass die Umgebung des Quellsystems zum Zeitpunkt der Entnahme stabil sein sollte. Allerdings kann die Menge der Grundwasserneubildung aus dem Vorjahr einen erheblichen Einfluss auf die Zusammensetzung des Quellwassers im darauffolgenden Winter haben. Nach Angaben des Water Resources Data System & State Climate Office of Wyoming (www.wrds.uwyo.edu) hatte das Gebiet um WCD in den Jahren 2017 und 2018 eine ungewöhnlich hohe Schneedecke (die sich auf die Daten von 2018 und 2019 auswirkte) im Vergleich zu den Vorjahren und den Folgejahren. Am 1. März 2017 und 2018 betrug das Schneewasseräquivalent 110 % bzw. 124 % des Jahreszeitendurchschnitts. Das Schneewasseräquivalent betrug im Jahr 2016 88 % des Medians, was möglicherweise Auswirkungen auf die Daten von 2017 hatte. Dieser SWE-Trend, der auf eine Zunahme der Schneedecke von 2016 bis 2018 hinweist, korreliert mit dem Verlust einzigartiger stickstoff- und schwefelhaltiger Verbindungen und dem Rückgang der Archaeen. Eine Pearson-Korrelationsanalyse ergab eine starke negative Korrelation von –0,99 zwischen SWE und der archaealen Alpha-Diversität mit einem p-Wert von 0,0031. Während der erhöhten Abflüsse in der Saison 2017 und 2018 aufgrund hoher Schneedecke hat sich die Zusammensetzung des heißen Quellwassers wahrscheinlich erheblich verändert, was zu deutlichen Unterschieden in der Zusammensetzung kleiner Moleküle in der Umwelt geführt hat. Es wurde bereits vermutet, dass der Abfluss der Schneedecke bestimmte Populationen von Archaeen in heißen Quellen moduliert. Campbell et al. beobachteten zeitliche Veränderungen in den Populationen von Sulfolobus islandicus in verschiedenen heißen Quellen im YNP, die nicht mit den gemessenen geochemischen Veränderungen korrelierten, die in den Quellen beobachtet wurden43. Es wurde angenommen, dass diese Veränderungen auf Abfluss oder andere hydrogeochemische Störungen zurückzuführen sind.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Analyse einen Teil der Komplexität und Dynamik der Ökologie thermoalkalischer Quellen charakterisiert hat. Es zeigte sich auch, dass thermophile Archaeen möglicherweise empfindlich auf kleine Umweltstörungen reagieren. Die Kombination von geochemischen Standardtechniken mit der neuartigen Massenspektrometrie-Analyse kleiner Moleküle zeigte die Grenzen der alleinigen Verwendung von Elementzusammensetzung und geochemischen Standardmessungen, wie z. B. gelöstem Sauerstoff, zur Bewertung von Veränderungen in komplexen Umweltsystemen auf. Die massenspektrometrische Analyse identifizierte spezifische Veränderungen in der Zusammensetzung kleiner Moleküle, die mit der relativen Häufigkeit der Archaeen korrelierten. Mit einer rein geochemischen Analyse wären solche Zusammenhänge übersehen worden. Unsere umfassende Studie ergab, dass es zwischen 2017 und 2019 zu Umweltereignissen kam, die möglicherweise mit der Schneedecke zusammenhängen und die Zusammensetzung der heißen Quellen veränderten. Dies äußerte sich in Übergängen stickstoff- und schwefelhaltiger Verbindungen, was mit Stoffwechselveränderungen und einem relativen Rückgang der Archaeen korrelierte.

Der FS-Standort (Yellowstone Research Coordination Network Database LWCG023A, LWCG023B, LWCG023C) besteht aus einer Gruppe alkalischer Chloridquellen in der südöstlichen Ecke des Lower Geyser Basin im WCD (44,5325°N, 110,7971°W, White Creek). fließt den Abfluss hinunter und wird von mehreren thermoalkalischen Quellen begleitet, darunter Spindle Geyser (LWCG149) und zwei der am besten untersuchten Standorte in YNP, Octopus Spring (LWCG138) und Mushroom Spring44. Der FS-Standort liegt einige Meter südlich von White Creek an einem steil geneigter Hügel und besteht aus drei Quellen und fünf verschiedenen Becken (FS1-FS5). FS1 wird von einem kleinen Geysir gespeist und ist oberirdisch mit FS2 und FS3 verbunden. Es gibt jedoch keine sichtbare oberirdische Verbindung zwischen FS3 und FS4 Möglicherweise besteht eine unterirdische Verbindung zwischen den beiden Quellen. FS4 und FS5 sind oberirdisch verbunden, und der Abfluss von FS5 setzt sich von der Quellengruppe weg fort und mündet in White Creek. FS1 ist mit mehreren Metern Breite und Tiefe die größte Quelle, gefolgt von FS5 , FS3, FS2 und FS4.

In den Jahren 2017, 2018 und 2019 wurden innerhalb einer Woche nach dem ersten Märztag Proben entnommen. Durch die Probenahme zur gleichen Jahreszeit ermöglichte diese Analyse einen langfristigen Blick auf nicht-saisonale Veränderungen in einer thermoalkalischen Quelle. Zur Probenentnahme aus jeder Quelle wurden Edelstahlbecher auf ausziehbaren Stangen verwendet. Die Becher wurden vor jeder Probenahmefahrt mit 70 %igem Ethanol sterilisiert, zunächst mit Quellwasser gespült und dann zum Sammeln einer kleinen Menge Sedimentschlamm verwendet. Die Proben wurden in dreifacher Ausfertigung gesammelt und an drei entfernten Standorten innerhalb jeder Quelle entnommen, wobei an jedem Probenahmeort gepaarte Teilproben für Metabarcoding und Massenspektrometeranalyse gesammelt wurden. Für die Analyse wurden in allen drei Jahren in jedem Frühjahr die gleichen Probenahmestellen verwendet. Für jede Probe wurden 15 ml Sedimentschlamm gesammelt, der aus ca. 8 ml Sediment und ca. 7 ml Thermalwasser bestand. Die gesammelten Proben wurden in sterile konische 15-ml-Zentrifugenröhrchen (Corning, Corning, NY) gegeben. Aufschlämmungsproben wurden sofort vor Ort in einem Trockeneis- und Ethanolbad eingefroren und bis zum Transport zur Montana State University (MSU) auf Trockeneis gelagert und bis zur Genom- oder LCMS-Analyse bei –80 ° C gelagert.

Bei jeder Probenahme wurde die Geochemie des Wassers überwacht. Kurz gesagt, die Temperatur und der pH-Wert jedes Standorts wurden in situ unter Verwendung einer kombinierten pH-Temperatur-Sonde (Hach HQ30d, Hach Co., Loveland, CO) gemessen. Der gelöste Sauerstoff wurde vor Ort mit der High Range Dissolved Oxygen-Methode und einem tragbaren Kolorimeter (Hach DR900, Hach Co., Loveland, CO) (HELM) gemessen. Die insgesamt gelösten Metalle wurden mit 0,22 µm filtersterilisiertem Wasser analysiert, das mit 5 % Salpetersäure in Spurenmetallqualität angesäuert war. Die Konzentrationen der Gesamtmetalle wurden mit einem Agilent 7500ce ICP-MS durch Vergleich mit zertifizierten Standards (Agilent Technologies, Environmental Calibration Standard 5183–4688) in der Umwelt- und Biofilm-Massenspektrometrie-Einrichtung der MSU quantifiziert. Proben für die Anionenanalyse wurden durch 0,22-µm-Filter filtriert und das Filtrat mit einem Dionex ICS-1100-Chromatographiesystem (Dionex Corp., Sunnyvale, CA) analysiert, das mit einer 25-µl-Injektionsschleife und einem Anionenaustauscher AS22-4 × 250 mm ausgestattet war Säule unter Verwendung einer Elutionsmittelkonzentration von 4,5 mmol/l Natriumcarbonat und 1,4 mmol/l Natriumbicarbonat mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml/min. Proben für Gesamtkohlenstoff (TC), Gesamtstickstoff (TN), nicht ausspülbaren organischen Kohlenstoff (NPOC) und gelösten anorganischen Kohlenstoff (IC) wurden durch 0,22-µm-Filter filtriert und das Filtrat in verasche Glasfläschchen ohne Kopfraum abgelagert mit einem Septum verschlossen. Ein Shimadzu TOC-CSH-Gerät mit angeschlossenem TN-Modul (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD) wurde zur Messung von TC/TN/NPOC/IC im Environmental Analytical Lab (EAL) der MSU verwendet. Mit Schwefelsäure angesäuerte gefilterte Proben (endgültiger pH-Wert < 2) wurden ebenfalls zur Ammoniumanalyse mit einem Lachat QuickChem 8500 Durchflussinjektionsanalysator (Hach Co., Loveland, CO) an die EAL geschickt.

Jedes Frühjahr wurde in jedem Jahr der Studie dreifach beprobt und jede dieser Proben wurde für die Metabarcoding-Analyse verwendet. Die DNA wurde aus jedem Replikat mit dem FastDNA™ Spin Kit for Soil Kit (MP Biomedicals) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert, mit einem zusätzlichen 40-sekündigen Perlenschlagschritt. Die V4-Region des 16S-rRNA-Gens wurde mit den neuesten Versionen der 515F-80R-Primer45, 515F-A (GTGYCAGCMGCCGCGGTAA;46) und 806R-B ​​(GGACTACNVGGGTWTCTAAT;47) unter Verwendung der Phusion Hot Start II Hi Fidelity-Polymerase in 25-µl-Reaktionen gezielt angesteuert . Diese Primer sind die am weitesten verbreiteten im Bereich der mikrobiellen Ökologie46,47,48 und es wurde durchweg festgestellt, dass sie sowohl eine Unterscheidungskraft als auch eine geringe Voreingenommenheit gegenüber bestimmten taxonomischen Gruppen aufweisen49. Die Thermocycling-Bedingungen waren eine anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 30 s, 22 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 15 s, Tempern bei 58 °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 20 s und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C C für 5 Min. Um das Multiplexen zu erleichtern, wurden in einer zweiten PCR mit dem Nextera-Kit (Illumina Inc.) Dual-Index-Barcodes mit 10 Zyklen wie oben hinzugefügt, jedoch mit einer Annealing-Temperatur von 55 °C. PCR-Reaktionen wurden mit dem Quant-It HS dsDNA-Kit (Invitrogen) quantifiziert und mit einem Biotek H2-Plattenlesegerät gemessen. Die Reaktionen wurden in gleichen Konzentrationen gepoolt und auf einem MiSeq unter Verwendung von V3 600 Cycle Kits sequenziert.

Paired-End-Lesevorgänge wurden zusammengeführt, Primer entfernt und Sequenzen mit einer erwarteten Fehlerrate von 0,5 unter Verwendung von USEARCH Version 1150,51 qualitätsgefiltert. Operationelle taxonomische Einheiten (OTUs) wurden mithilfe der UNOISE-Version 3 identifiziert, die biologische Sequenzen identifiziert, die in OTUs mit Nullradius (ZOTUs) geclustert sind, ähnlich wie Amplikonsequenzvarianten. ZOTU-Tabellen wurden durch die Zuordnung von Lesevorgängen zu repräsentativen ZOTU-Sequenzen generiert. Die Taxonomie von ZOTUs wurde mithilfe des Online-Klassifikators IDTAXA über DECIPHER Version 2.20.0 (http://DECIPHER.codes)52 identifiziert. Archaeale Sequenzen wurden einem Referenzbaum hinzugefügt, der unter Verwendung vollständiger und nahezu vollständiger 16S-Sequenzen erstellt wurde, die von der GenBank und der Genome Taxonomy-Datenbank heruntergeladen wurden53. Die Sequenzen wurden mit MAFFT Version 7.487 abgeglichen und die Referenzphylogenie wurde mit maximaler Wahrscheinlichkeit mit RAxML Version 8.054,55 erstellt. Umgebungssequenzen wurden an der Referenz ausgerichtet und mit pplacer, Version 1.1, zum Baum hinzugefügt, und die kombinierten Bäume wurden mit dem Interactive Tree of Life Version 6 (http:www.itol.embl.de) kommentiert56,57. Die statistische Analyse wurde durchgeführt, indem die relativen Häufigkeitsdaten der 16S-rRNA-ZOTU mit MicrobiomeAnalyst untersucht wurden, um jahr- und frühlingsspezifische mikrobielle Trends zu bestimmen58.

Ähnlich wie bei der Metabarcoding-Analyse wurden für jede jährliche Analyse drei gesammelte Proben aus jedem Frühjahr verwendet. Die Analyse aller jährlichen Proben erfolgte gleichzeitig. Sedimentproben wurden mit verschiedenen Methoden extrahiert, was zu Fraktionen kleiner Moleküle führte, die durch LCMS-Analyse charakterisiert wurden. Die Extraktion begann mit dem Auftauen gefrorener Proben in einem 40 °C warmen Wasserbad. Mikroben wurden durch zwei 1-minütige Rührrunden auf einer Wirbelmaschine entfernt. Es wurde nicht festgestellt, dass zusätzliches Rühren die interzellulären Ausbeuten kleiner Moleküle steigert. Gut gemischte Proben wurden dann 5 Minuten lang bei 400 U/min zentrifugiert, um ein Sedimentpellet zu erzeugen. Der klare Überstand wurde dann gesammelt und in ein sauberes Fläschchen gegeben und der Vorgang wurde unter Zugabe von 5 ml Milli-Q-Waschwasser wiederholt. Der Waschüberstand wurde zum ursprünglichen sedimentfreien Überstand hinzugefügt. Der kombinierte Überstand wurde dann 15 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erzeugen. Der Überstand wurde in einem sauberen Fläschchen für die Analyse der extrazellulären Festphasenextraktion (SPE) gesammelt und dem Zellpellet wurde ausreichend Phosphatpufferlösung (1X PBS) zugesetzt, um das Pellet vollständig zu bedecken.

Die extrazelluläre Schicht wurde zunächst mit Ameisensäure (Fisher Chemical, Hampton, ND) auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und es wurden Agilent Bond Elut PPL-Festphasenextraktionskartuschen (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) vorbereitet. Die Vorbereitung umfasste zwei Kartuschenvolumenzugaben von Methanol (Fisher Chemical, Hampton, NH), gefolgt von zwei Kartuschenvolumenzugaben von Milli-Q-Wasser und einer abschließenden Kartuschenvolumenzugabe von Methanol. Anschließend wurden SPE-Kartuschen an einen SPE-Verteiler (VacMaster 10, Biotage, Uppsala, Schweden) und eine Vakuumpumpe angeschlossen, um extrazelluläre kleine Moleküle selektiv zu konzentrieren und zu isolieren. Angesäuerte Proben wurden durch die Kartuschen geleitet und dann zur Trockne unter N2 gestellt. Saubere Fläschchen wurden unter die Kartuschen gestellt und eingefangene extrazelluläre kleine Moleküle wurden mit 1 ml Methanol eluiert. Extrazelluläre kleine Moleküle wurden unter Unterdruck mit einem Concentrator Plus (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) weiter konzentriert, bis sie trocken waren, und dann bei –80 ° C gelagert, bis sie für die LCMS-Analyse bereit waren.

Das Fläschchen mit dem Zellpellet wurde bei 400 U/min zentrifugiert und der PBS-Überstand entfernt. Es wurden zwei Zellpelletvolumina Extraktionspuffer hinzugefügt, bestehend aus 8 M Harnstoff (Fisher Chemical, Hampton, NH), 0,1 M Tris-HCL (MilliporeSigma, München, Deutschland), 50 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (MilliporeSigma, München, Deutschland). und 1X Proteaseinhibitormischung (MilliporeSigma, München, Deutschland). Anschließend wurden die Zellpellets in einem zweiteiligen Verfahren lysiert. Zunächst wurden Zellpellets in Extraktionspuffer für 10 Sekunden in flüssigen Stickstoff gegeben, dann entfernt und auftauen gelassen. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Nach dem Einfrier-/Auftauvorgang wurden die Zellpellets zwei Ultraschallrunden mit einem Ultraschallhomogenisator 3000 von Biologics Inc. (Bioloics, Manassas, VA) unterzogen, der 3 Minuten lang auf einen Arbeitszyklus von 40 % eingestellt war.

Nach der Zelllyse wurden die intrazellulären Proben 30 Minuten lang bei 15.000 U/min zentrifugiert, um Zelltrümmer zu pelletieren. Der resultierende Überstand wurde entfernt und in ein sauberes Fläschchen gegeben, während die Trümmer unter Zugabe von 50 µl Extraktionspuffer gewaschen wurden. Nach dem Rühren der Trümmer mit einer Vortexmaschine wurden die Proben 30 Minuten lang bei 15.000 zentrifugiert. Der zweite Überstand wurde erneut entfernt und in das Fläschchen gegeben, das den ersten Überstand enthielt. Anschließend wurden vier Probenvolumina eiskaltes Aceton (Fisher Chemical, Hampton, NH) zugegeben, um das Protein auszufällen. Die Proben wurden 2 Stunden lang in einen Gefrierschrank mit –80 °C gelegt, um die Niederschlagsbildung zu unterstützen. Nach 2 Stunden wurden die Proben 5 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert und der intrazelluläre Überstand gesammelt und in ein sauberes Fläschchen gegeben. Wie bei der extrazellulären Schicht kleiner Moleküle wurde auch die intrazelluläre Schicht kleiner Moleküle unter Unterdruck zur Trockne konzentriert und bis zur LCMS-Analyse bei –80 °C gelagert. Als sie für die LCMS-Analyse bereit waren, wurden sowohl die intrazellulären als auch die extrazellulären Proben kleiner Moleküle mit 50 µL Methanol:Wasser (50:50) rekonstituiert und in saubere MS-Fläschchen gegeben.

Die Proben wurden auf einem Agilent 6538 Q-TOF MS in Kombination mit einer Agilent 1290 Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) unter Verwendung eines 132 Å, 2,2 μm, 2,1 mm × 150 mm großen Cogent Diamond Hydride analysiert HPLC-Säule (Microsolv, Greater Wilmington, NC) in der Proteomik-, Metabolomik- und Massenspektrometrie-Einrichtung der MSU. Die Ionisierung wurde durch Elektrospray-Ionisierung im positiven Modus erreicht. Die mobilen Phasen A und B bestanden aus Wasser mit 0,1 % Ameisensäure bzw. Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure. Es wurde eine UHPLC-Laufzeit von 15 Minuten verwendet, beginnend mit 100 % mobiler Phase B und anschließend in einem linearen Gradienten über 14 Minuten bis zu 30 % B. Nach 14 Minuten wurde die mobile Phase B für die letzte Minute des UHPLC-Laufs wieder auf 100 % erhöht. Der Durchfluss wurde bei 600 µL/min gehalten und die Temperatur im Säulenraum lag konstant bei 30 °C. Die Proben wurden mittels Elektrospray-Ionisation mit einer Kapillarspannung von 3500 V und einer Quellentemperatur von 150 °C mit Stickstoff als Desolvatisierungsgas bei 350 °C ionisiert. Es wurden Spektren im Bereich von 50 bis 1000 m/z gesammelt. Während der gesamten Analyse wurden gepoolte Proben untersucht und während der Probenanalyse auf Kontinuität beobachtet. Gepoolte Proben wurden auch verwendet, um Variationskoeffizienten aus den Konzentrationen einer zufällig ausgewählten Gruppe von Metaboliten zu berechnen, und es wurde ein Mittelwert von 4,8 % berechnet.

LCMS-Rohdatendateien wurden mit MSConvert Version 3.0 mit Vendor Peak Picking in .mzML-Dateien konvertiert und das Data Mining wurde mit mzMine Version 2.5359,60 durchgeführt. Während des gesamten Abbauprozesses wurde eine Mindestintensität von 1.000 Zählungen zusammen mit einem Fehler von 20 ppm und einer Zeitdiskrepanz von 0,1 Minuten zur Bestimmung eindeutiger Peaks verwendet. Molekulare Formeln wurden mithilfe der Formelgenerierungs-Identifikationsfunktion von mzMine mit einem Fehler von 15 ppm bestimmt. Um die Zuordnungen der Molekülformeln und das Vorhandensein von Stickstoff und Schwefel zu validieren, wurden MS-Merkmale von 50 kleinen Molekülen untersucht (Ergänzungstabellen 2 und 3). Jedes dieser Merkmale kleiner Moleküle wurde im folgenden Abschnitt über statistische Korrelationen ausgewählt und alle möglichen organischen Molekülformeln wurden unter Verwendung des m/z-Werts und eines Grenzwerts von 15 ppm abgeleitet61. 79 % der möglichen Formeln für die m/z-Werte der vorhergesagten Schwefelgruppe enthielten Schwefel. Stickstoff war sogar noch konsistenter, da 89 % der möglichen Formeln Stickstoff enthielten. Obwohl für viele der mit LCMS gemessenen m/z-Massenwerte mehrere Formeln möglich waren, stimmte das Vorhandensein von Stickstoff oder Schwefel in den meisten möglichen Formelzuordnungen überein.

Nach dem Data Mining wurden Leerproben verwendet, um verbleibende Merkmale aus den Datensätzen zu entfernen. Merkmale wurden nur dann in den experimentellen Daten beibehalten, wenn sie eine fünfmal größere Fläche als die Blindprobe aufwiesen. Mit dieser Methode wurden fast 5.000 kombinierte Merkmale in den Proben extrazellulärer kleiner Moleküle und fast 3.200 Merkmale in den kombinierten intrazellulären Proben kleiner Moleküle gefunden. Die Identifizierung der Metaboliten basierte auf genauen Übereinstimmungen von Masse und Retentionszeit mit authentischen Standards aus einer hauseigenen Bibliothek. Die interne Bibliothek enthielt über 400 Metaboliten, die mit derselben LC-Säule, demselben Instrument und derselben Methode wie die Probenanalyse analysiert wurden. Zur positiven Kommentierung von Merkmalen wurden ein Fehler von 15 ppm und ein Retentionszeitfenster von 0,25 Minuten verwendet. Anschließend wurden die Datensätze mit MetaboAnalyst Version 4.0 (http:www.metaboanalyst.ca)62 gruppiert und analysiert. Merkmale wurden entfernt, wenn nicht in über 50 % der Proben. Als nächstes wurden die Daten anhand ihres Interquartilbereichswerts gefiltert und durch Summe und automatische Skalierung normalisiert. Die Signalweganalyse wurde auch in MetaboAnalyst unter Verwendung eines Holms-p-Werts (p < 0,05) durchgeführt, um die Signifikanz jedes Signalwegs zu bestimmen. Der Holms-p-Wert ist ein korrigierter Wert, der mehrere Vergleiche berücksichtigt. Außerdem wurde ein Metabolic Pathway Analysis (MetPA)-Score (Impact Score > 0,1) berechnet, um wirkungsvolle Signalwege basierend auf der Bedeutung der identifizierten Metaboliten in jedem spezifischen Signalweg objektiv aufzuklären63,64.

Die geochemischen, 16S-rRNA-, intrazellulären und extrazellulären Datensätze kleiner Moleküle wurden mithilfe von Korrelogrammen verglichen. Korrelogramme identifizieren Variablen, die Gruppen unterscheiden, in diesem Fall nach Jahr, und berechnen dann die Stärke und statistische Signifikanz der Korrelation. Diese Analyse wurde unter Verwendung der Pakete Bioconductor v3.15 und mixOmics v6.1 in R (http:www.bioconductor.org) (http:www.mixOmics.org)65,66 durchgeführt. Zwei Datensätze wurden gleichzeitig verglichen und die wichtigsten Unterscheidungsmerkmale wurden mithilfe einer partiellen Unterscheidungsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate (PLS-DA) bestimmt. Die wichtigsten Merkmale aus jedem Datensatz wurden dann zwischen Quellen und Jahren verglichen, um ihre korrelative Beziehung zu bestimmen. Außerdem wurde für jede Beziehung eine ANOVA-Analyse durchgeführt, um die Signifikanz der Korrelation zu bestimmen.

Die in dieser Studie gemeldeten Nukleotidsequenzdaten sind in der MG-RAST-Datenbank unter der Zugangsnummer mgm4929532.3 [www.mgrast.org/mgmain.html?mgpage=project&project=mgp98643] verfügbar. Die in dieser Studie berichteten Daten zu kleinen Molekülen und zur Metabolomik sind in der MetaboLights-Datenbank unter der Kennung MTBLS5344 [www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS5344] verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren möchten dem National Park Service dafür danken, dass er uns freundlicherweise die Probenahme im YNP ermöglicht hat (Genehmigung YELL-2017-SCI-5480 bis YELL-2020-SCI-5480). Wir möchten uns auch bei Jesse Thomas und Ganesh Balasubramanian von der Proteomics, Metabolomics, and Mass Spectrometry Facility der Montana State University für ihr Fachwissen bedanken. Wir danken der WM Keck Foundation für die Finanzierung dieser Forschung.

Dieser Artikel wurde vom National Institute General Medical Sciences (P20GM103474), den National Institutes of Health (S10OD28650), der National Science Foundation (CHE1852214) und der WM Keck Foundation finanziert.

Abteilung für Chemie und Biochemie, Montana State University, Bozeman, MT, 59717, USA

Jesse T. Peach, Sutton Kanta, Eric Boltinghouse, Bailey Sharon, Valerie Copié und Brian Bothner

Thermal Biology Institute, Montana State University, Bozeman, MT, 59717, USA

Rebecca C. Mueller, Dana J. Skorupa, Margaux M. Mesle, Brian Bothner und Brent M. Peyton

Abteilung für Chemie- und Biotechnik, Center for Biofilm Engineering, Montana State University, Bozeman, MT, 59717, USA

Rebecca C. Mueller, Dana J. Skorupa, Margaux M. Mesle und Brent M. Peyton

Abteilung für Bio- und Chemieingenieurwesen, Montana State University, Bozeman, MT, 59717, USA

Brent M. Peyton

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JP konzipierte die Studie, sammelte Proben für die MS-Analyse, führte die Extraktion und Analyse kleiner Moleküle durch, führte die MS-Analyse durch, interpretierte die MS und stellte Analysedaten zusammen und verfasste das Manuskript. RM sammelte Proben, führte die 16S-Analyse durch und half bei der Manuskripterstellung. DS sammelte Proben, führte die geochemische Analyse durch und half bei der Manuskripterstellung. MM sammelte Proben und half bei der Manuskripterstellung. SK sammelte Proben und führte die Extraktion kleiner Moleküle durch. EB führte die Extraktionen kleiner Moleküle durch. BS sammelte Proben und führte die Extraktion kleiner Moleküle durch. VC konzipierte die Studie und half bei der Manuskripterstellung. BB konzipierte die Studie, interpretierte die Ergebnisse und unterstützte bei der Manuskripterstellung. BP konzipierte die Studie, sammelte Proben, interpretierte die Ergebnisse und unterstützte bei der Erstellung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Jesse T. Peach oder Brian Bothner.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Peach, JT, Mueller, RC, Skorupa, DJ et al. Eine Längsschnittanalyse der heißen Quellen der Five Sisters im Yellowstone-Nationalpark zeigt eine dynamische thermoalkalische Umgebung. Sci Rep 12, 18707 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22047-w

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Eingegangen: 13. Juli 2022

Angenommen: 07. Oktober 2022

Veröffentlicht: 04. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22047-w

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