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Sep 02, 2023

Saisonale Aktivitäten des Phyllosphären-Mikrobioms mehrjähriger Kulturpflanzen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1039 (2023) Diesen Artikel zitieren 5666 Zugriffe 1 Zitate 79 Details zu altmetrischen Metriken Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1039 (2023) Diesen Artikel zitieren

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1 Zitate

79 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen kann das Mikrobiommanagement beeinflussen, um die Produktivität und Widerstandsfähigkeit von Pflanzen gegenüber Stress zu verbessern. Hier wenden wir einen genomzentrierten Ansatz an, um ökologisch wichtige Mitglieder des Blattmikrobioms auf replizierten Parzellen von im Freiland angebauten Rutenhirsen und Chinaschilf zu identifizieren und ihre Aktivitäten über zwei Vegetationsperioden für Rutenhirse zu quantifizieren. Wir verwenden Metagenom- und Metatranskriptomsequenzierung und kuratieren 40 Metagenom-assemblierte Genome (MAGs) mittlerer und hoher Qualität. Wir stellen fest, dass die durch diese MAGs repräsentierten Klassen (Actinomycetia, Alpha- und Gamma-Proteobacteria und Bacteroidota) in der Spätsaison aktiv sind und die Transkripte für kurzkettige Dehydrogenase, Molybdopterinoxidoreduktase und Polyketidcyclase hochregulieren. Bei den meisten MAGs kommen stressassoziierte Signalwege zum Ausdruck, was auf eine Interaktion mit der Wirtsumgebung schließen lässt. Wir entdecken auch saisonal aktivierte Biosynthesewege für Terpene und verschiedene nicht-ribosomale Peptidwege, die schlecht annotiert sind. Unsere Ergebnisse belegen, dass blattassoziierte Bakterienpopulationen saisonal dynamisch sind und auf Wirtssignale reagieren.

Mehrjährige Pflanzen sind ein entscheidendes Ziel für die nachhaltige Entwicklung von Biokraftstoffen1,2,3. Mehrjährige Pflanzen liefern nicht nur einen hohen Biomasseertrag, der in Biokraftstoffe und Bioprodukte umgewandelt werden kann, sondern bieten auch ein breites Spektrum an Ökosystemdienstleistungen, die Bemühungen zur Eindämmung des Klimawandels unterstützen, einschließlich der Minderung von Treibhausgasen und der Förderung des Nährstoffkreislaufs im Boden1,4,5,6. Wie alle Pflanzen beherbergen Stauden vielfältige Mikrobiota, und von vielen dieser Mikroben ist entweder bekannt oder es wird erwartet, dass sie ihren Wirten zugute kommen. Beispielsweise können pflanzenassoziierte Mikroben die Produktivität steigern und vor Umweltstressoren schützen. Aufgrund der engen Bindung vieler pflanzenassoziierter Mikrobiommitglieder an den Wirt ist die Bewirtschaftung des Pflanzenmikrobioms ein vorgeschlagenes Instrument zur Förderung der Pflanzenvitalität und zur Unterstützung der Widerstandsfähigkeit der Pflanzen gegenüber globalen Klimaveränderungen7,8,9,10. Daher wird erwartet, dass die Regulierung des Pflanzenmikrobioms neben selektiver Züchtung und datengestütztem Feldmanagement von strategischer Bedeutung für die nachhaltige Produktion von Biokraftstoff-Rohstoffen sein wird.

Pflanzen haben anatomische Kompartimente, die jeweils von unterschiedlichen mikrobiellen Konsortien bewohnt werden. Im Allgemeinen verengen sich Vielfalt und Zusammensetzung des pflanzlichen Mikrobioms von den äußeren Kompartimenten zu den inneren, und die Pflanze spielt eine aktive Rolle bei der Filterung der Mikrobiomzusammensetzung nach innen11,12,13. Zu den äußeren Pflanzenkompartimenten gehören die Wurzelzone, die Rhizosphäre und die Rhizoebene unter der Erde sowie die oberirdische epiphytische Phyllosphäre14. In externen Kompartimenten sind transiente oder kommensale mikrobielle Taxa relativ häufig vertreten, und diese Kompartimente interagieren mit Mikroben aus der unmittelbaren Umgebung und rekrutieren diese. Zu den inneren Kompartimenten gehört die Endosphäre ober- und unterirdischer Gewebe. Diese weisen einen relativ geringen Reichtum auf und beherbergen die am meisten ausgewählten Mikrobiota15,16. Von diesen Kompartimenten hat die Rhizosphäre als kritischer Ort der Wechselwirkungen zwischen Mikroben und Pflanzen, die für die Nährstoff- und Wasseraufnahme wichtig sind, die größte Aufmerksamkeit erhalten (z. B. Kuzyakov und Razavi17). Mitglieder der Mikrobiota, die in der Phyllosphäre leben, erfüllen jedoch auch wichtige Pflanzenfunktionen, wie den Ausschluss von Krankheitserregern und die Immunaktivierung18,19. Phyllosphären-Mikroorganismen haben spezielle Anpassungen an ihren exponierten Lebensstil16,20,21,22 und tragen zum globalen Kohlenstoff- und anderen biogeochemischen Kreislauf bei, einschließlich klimarelevanter Transformationen23,24,25, und bewohnen die größte oberirdische Oberfläche26. Da mehrjährige Biokraftstoffe häufig so ausgewählt werden, dass die Blattoberfläche maximiert wird, wird erwartet, dass das Verständnis des Phyllosphären-Mikrobioms Einblicke in mikrobielle Interaktionen liefert, die der Pflanze zugute kommen, um Produktivität und Stressresistenz zu unterstützen.

Bei der Regulierung des Mikrobioms zur Förderung der Pflanzenvitalität und der Widerstandsfähigkeit gegenüber Umweltstress gibt es zwei allgemeine Herausforderungen. Die erste Herausforderung besteht darin, die nützlichen Mitglieder des Pflanzenmikrobioms von vorübergehenden oder kommensalen Mitgliedern zu unterscheiden, wobei zu berücksichtigen ist, dass sich einige Mitglieder, die dem Wirt Vorteile bieten, wahrscheinlich situativ ändern, entweder im Laufe der Pflanzenentwicklung oder aufgrund von Umweltstress27,28,29, während andere stabil sind30 ,31. Die zweite Herausforderung besteht darin, dass Pflanzen und ihre Agrarökosysteme im Laufe der Vegetationsperiode zeitlich dynamisch sind und auch die damit verbundene Mikrobiota dynamisch ist. Es ist derzeit unklar, welche Funktionen mit der mikrobiellen Dynamik der Phyllosphäre und ihren möglichen Wechselwirkungen mit Pflanzenwirten verbunden sein könnten.

Zuvor verwendeten wir die 16S-rRNA-Gen-Amplikonanalyse, um eine „Kern“-Kohorte von Bakterien- und Archaeen-Taxa zu identifizieren, die dauerhaft mit den Phylosphären-Mikrobiomen von zwei mehrjährigen Biokraftstoff-Rohstoffen, Chinaschilf und Rutenhirse, assoziiert waren. Eine dauerhafte Mitgliedschaft wurde durch das Sammeln von Blattproben auf wiederholten Feldparzellen, über einen gemäßigten Saisonzyklus und über zwei jährliche Vegetationsperioden für Rutenhirse32 hergestellt. Andere Studien an Rutenhirse haben in ähnlicher Weise berichtet, dass das Blatt durch seine Mikrobiomzusammensetzung von anderen Pflanzenkompartimenten unterschieden werden kann (z. B. 33,34,35,36,37), was auf eine Selektion auf das Blattkompartiment hindeutet. In der aktuellen Studie wollten wir die funktionellen Eigenschaften und Aktivitäten persistenter Phyllosphären-Taxa verstehen, mit einem Interesse an speziellen Anpassungen an das Blatt und Interaktionen mit der Wirtspflanze, die die Mechanismen und die Art der Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben beeinflussen könnten. Daher führten wir eine saisonale Analyse der Phyllosphären-Metagenome für Chinaschilf und Rutenhirse durch, wobei wir Nukleinsäuren aus denselben Proben verwendeten, die für die Amplikonanalyse verwendet wurden. Wir haben unsere Metagenom-Längsschnittserien mit Metatranskriptomanalysen zu ausgewählten Zeitpunkten in der Phänologie der Rutenhirse gepaart, um zu bestimmen, welche Funktionen saisonal aktiv waren. Wir führten genomzentrierte Analysen des Metagenoms durch und konzentrierten uns auf das Verständnis der saisonalen Dynamik und Funktionen einer zentralen Untergruppe von Metagenom-assemblierten Genomen (MAGs) mittlerer und hoher Qualität, die wir aus diesen Daten einordnen konnten. Unsere Ergebnisse zeigen Funktionen, die einen blattassoziierten Lebensstil und saisonale Aktivitäten persistenter Phyllosphärenmitglieder unterstützen. Schließlich liefern wir Beweise dafür, dass diese Genome an verschiedenen Standorten und Jahren nach unseren ursprünglichen Untersuchungsflächen nachgewiesen wurden, was darauf hindeutet, dass es sich um allgemeine, beständige Bewohner von Bioenergiegräsern im Mittleren Westen der USA handelt.

Hier sind wir von unserer vorherigen Mikrobiomprofilierung (mit 16S-rRNA-Amplikonsequenzierung) übergegangen, um die zeitliche Dynamik des epiphytischen Phyllosphärenmikrobioms der mehrjährigen Biokraftstoff-Rohstoffe Miscanthus und Rutenhirse32 zu verstehen, und untersuchen nun die funktionellen Gene und saisonalen Aktivitäten der fokalen Phyllosphärenpopulationen. In unserer vorherigen Studie haben wir „Kern“-Mitglieder dieser Mikrobiome anhand ihrer zeitlichen Persistenz und Belegung identifiziert. Hier haben wir aus Metagenomen zusammengesetzte Genome zusammengestellt, um die Analyse auf die beständigsten und am häufigsten vorkommenden Populationen und ihre saisonale Dynamik zu konzentrieren. Anschließend haben wir Metatranskripte für die zentralen MAGs rekrutiert, um deren saisonale Transkriptdynamik für Rutenhirse zu verstehen. Wir berichten zunächst über Überschneidungen zwischen den beiden unterschiedlichen Datensätzen bei der Erkennung von „Kern“- und „Fokus“-Populationen und ihrer Taxonomie, gehen dann zur Beschreibung der allgemeinen saisonalen Dynamik von MAGs und ihrer saisonalen Transkriptdynamik über und untersuchen schließlich die konsistenten erkannten und aktivierten Pfade über fokale MAGs hinweg, die auf einen blattassoziierten und/oder wirtsabhängigen Lebensstil hinweisen können. Außerdem haben wir nach diesen fokalen MAGs in anderen Metagenomen des Mittleren Westens gesucht, um mehr über ihre Verteilung zu erfahren.

Aus drei Hauptgründen verwendeten wir einen MAG-basierten Ansatz (im Gegensatz zur Isolierung und Genomsequenzierung zu jedem Zeitpunkt). Zunächst und vor allem haben wir einen MAG-basierten Ansatz verwendet, damit wir noch nicht kultivierbare Mitglieder erfassen und ihre funktionellen Gene abfragen konnten, ohne unser Verständnis des Phyllosphären-Mikrobioms durch Kultivierungsverzerrungen zu beeinflussen. Zweitens wollten wir eine Übereinstimmung der beobachteten Transkripte mit funktionellen Genen aus demselben Pool von Zelllysen und direkt gepaarten RNA- und DNA-Koextrakten erreichen. Drittens wollten wir den Durchsatz der kultivierungsunabhängigen Sequenzierung nutzen, um über Zeit und Raum eine relativ höhere Auflösung zu erreichen, als dies bei gleichen Kosten und Aufwand mit der kultivierungsabhängigen Genomsequenzierung von Isolaten möglich wäre.

Rutenhirse- und Miscanthusblätter wurden im Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) an der Kellogg Biological Station (KBS) in Hickory Corners, MI, USA (42o23'41,6'' N, 85o22'23,1'' W) gesammelt (Abb. 1). . Wir haben Rutenhirse (Panicum virgatum L., Sorte Cave-in-rock) und Chinaschilf (Miscanthus x giganteus) an den Standorten des Biofuel Cropping System Experiment (BCSE) beprobt (Parzellenreplikationen 1–4,32). Wir haben um acht Uhr Blätter von Rutenhirse und Chinaschilf gesammelt bzw. neun Zeitpunkten im Jahr 2016 und Switchgrass zu sieben Zeitpunkten in der Saison 2017 (Tabelle 1, Abb. 1, Zusatzdaten 1, Zusatzdaten 2). Von den Blattoberflächen isolierten wir Nukleinsäuren für die Metagenom- und Metatranskriptomanalyse (Abb. 2), einschließlich Qualitätskontrolle und Filterung (Abb. S1, Tabelle S1), Assemblierung, Kartierung, Annotation, Genom-Binning und Dereplikation (siehe Methoden).

A Der Studienstandort befindet sich in der Kellogg Biological Station (KBS), einem langfristigen ökologischen Forschungsstandort mit Schwerpunkt auf Agrarökosystemen im Südwesten von Michigan. B Vier replizierte, randomisierte Anbausystemblöcke aus dem Biofuel Cropping System Experiment (BCSE) wurden zu jedem Zeitpunkt für Rutenhirse (grün) und/oder Chinaschilf (blau) beprobt. Innerhalb jeder Parzelle wurden Proben aus einer gedüngten Hauptparzelle und einer unbefruchteten Nebenparzelle entnommen. C Symbolfüllung zeigt an, welche Sequenzierung an Proben zu welchen Zeitpunkten und für welche Ernte durchgeführt wurde. Ausgefüllte Quadrate zeigen Proben, die gesammelt wurden, und offene Quadrate zeigen Proben, die zu einem bestimmten Zeitpunkt mit einer bestimmten Ernte nicht gesammelt wurden. Im Jahr 2016 wurden sowohl Rutenhirse als auch Chinaschilf beprobt, im Jahr 2017 wurde nur Rutenhirse beprobt. Rutenhirse-Blätter wurden zur RNA-Extraktion und Metatranskriptom-Analyse zu einer Teilmenge von Zeitpunkten im Jahr 2016 und zu allen Zeitpunkten im Jahr 2017 in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Bemerkenswert ist, dass die hier vorgestellten neuen Metagenom- und Metatranskriptom-Datensätze mit den Proben der 16S-rRNA-Amplikonzeit überlappen Reihe vorgestellt in Grady et al.32und die ITS-Amplikon-Zeitreihe vorgestellt in Bowsher et al.96.

Die Werte für Rutenhirse werden hellgrün und für Chinaschilf dunkelgrün angezeigt. Der durchgezogene graue Pfeil stellt den gemeinsamen Analyseschritt für beide Datensätze dar. Die Abbildung wurde mit Lucidchart erstellt. Beachten Sie, dass Metatranskriptomdaten nur von Rutenhirse und nicht von Chinaschilf stammen.

Unter allen zusammengesetzten MAGs (n = 238) konzentrierten wir die Analyse auf 40, die basierend auf Vollständigkeits- und Kontaminationsstandards von hoher und mittlerer Qualität waren (Abb. 3A, Zusatzdaten 3)38. Der konsistente Nachweis dieser 40 MAGs sowohl in Miscanthus- als auch in Switchgrass-Proben (Abb. 4) legt nahe, dass ihre Ursprungspopulationen nicht wirtsspezifisch waren, sondern eher auf diese mehrjährigen Gräser verteilt waren; Dies stützt unsere früheren Ergebnisse der 16S-rRNA-Gen-Amplikon-Untersuchung, die eine erhebliche Überlappung der wichtigsten Blattbakterien-Taxa zwischen den beiden Kulturen ergab32. Darüber hinaus gab es 38 „Kern“-OTUs aus unserer vorherigen Umfrage, die aufgrund ihrer taxonomischen Identifizierung ebenfalls mit 25 fokalen MAGs assoziiert waren (Abb. 3B); In unserer vorherigen Studie wurden OTUs auf der Grundlage der Häufigkeit sowie der saisonalen und feldreplizierten Belegung priorisiert. Dies legt daher vorsichtig nahe, dass mehr als die Hälfte der fokalen MAGs die am häufigsten vorkommenden und am häufigsten nachgewiesenen Taxa in diesem Ökosystem darstellen. Die 40 fokalen MAGs repräsentierten am häufigsten die Ordnungen Rhizobiales (n = 8/40), Actinomycetales (n = 6/40), Burkholderiales (n = 6/40) und Sphingomonadales (n = 6/40) (Ergänzungsdaten 3).

Eine Fülle und Belegung von Genomen, die aus Metagenomen der Rutenhirse und der Phyllosphäre von Miscanthus zusammengestellt und gruppiert wurden. Die Qualitäts- und Kontaminationsbewertung wurde mit checkM ermittelt. Es wurden 40 fokale MAGs ausgewählt. Die Belegung ist der Anteil der 192 Metagenome, in denen ein MAG nachgewiesen wurde, und die Häufigkeit ist der durch die MAG-Abdeckung des Housekeeping-Gens (HKG) normalisierte Durchschnitt über die 192 Metagenome. Die Symbolgröße zeigt die prozentuale Vollständigkeit des MAG an und die Farbe zeigt die prozentuale Verunreinigung an, wobei kühlere Farben eine geringere Verunreinigung anzeigen. B Taxonomie fokaler MAGs, wie mit GTDB-tk annotiert, und taxonomische Überlappung mit den persistenten Taxa, die in unserer vorherigen 16S-rRNA-Gen-Amplikon-Umfrage32 entdeckt wurden, die an denselben Proben und Zeitreihen durchgeführt wurde. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Häufigkeit wird durch die Farbintensität angezeigt, wobei Blau für eine hohe und Weiß für eine geringe Häufigkeit steht. MAG-Häufigkeiten für: A Miscanthus 2016-Metagenome (metaG); B Switchgrass 2016 Metagenome; C Switchgrass 2017 Metagenome; D Switchgrass 2016-Metatranskriptome (metaT) und E Switchgrass 2017-Metatranskriptome. Die Häufigkeit von Metagenom-Contigs wurde geschätzt, indem das mittlere Basenpaar der Leserekrutierung durch die durchschnittliche mittlere Basenpaarabdeckung der Housekeeping-Gene dividiert wurde. Die Häufigkeit von Metatranskriptom-ORFs wurde auf der Grundlage der mittleren Basenpaarabdeckung aller auf ORFs abgebildeten Lesevorgänge geschätzt und durch die mittlere Basenpaarabdeckung von Housekeeping-Genen dividiert. Das gleiche Dendrogramm wird auf alle Panels angewendet und ist das Ergebnis einer hierarchischen Clusterung (siehe Abb. S2) der Metatranskriptom-Diversität und -Häufigkeit in Rutenhirse. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Fokale MAGs zeigten unterschiedliche saisonale Muster in ihrer gesamten Leserekrutierung sowohl für das Metagenom (Abb. 4A–C) als auch für das Metatranskriptom (Abb. 4D, E, S2), wobei eine frühe, späte und konsistente saisonale Erkennung beobachtet wurde. In den Metatranskriptomen beider Jahre (für Rutenhirse) kam es jedoch im Laufe der Zeit zu einer allgemeinen saisonalen Anreicherung bestimmter KEGG-Subsysteme, die durch die Transkripte dargestellt werden, mit Zunahmen in den späteren Monaten der Probenahme (Abb. S3). Beim Vergleich der kumulativen Häufigkeit der Transkripte jedes MAG zwischen den Probenahmedaten Anfang (Mai – Juni) und Ende (Juli – September) 2017 zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Transkription bei 38 von 40 MAGs und eine verminderte Transkription bei 1 MAG (S28) (zweiseitiger Kruskal). -Wallis-Test basierend auf Chi-Quadrat-Verteilung, p-Wert <0,05). Phänologisch gesehen entsprachen die Augustproben einem (späten) Spitzenwert der Biomasse und Fruchtbildung bei Rutenhirse und einem geschlossenen Blätterdach sowohl bei Rutenhirse als auch bei Chinaschilf. Die Seneszenz trat bei Rutenhirse bereits Mitte September und bei Chinaschilf erst im November auf. Bemerkenswert ist, dass die Rekrutierung von Metatranskriptom-Reads für die MAGs robust war, selbst wenn bei der Rekrutierung von Metatranskriptom-Reads eine inkonsistente Erkennung auftrat (Abb. 4), was darauf hindeutet, dass diese MAGs konstant aktiv waren und eine relativ hohe Aktivität aufwiesen, selbst wenn ihre Genomerkennung verdeckt war.

MAGs wurden basierend auf der Kohärenz der saisonalen Transkriptdynamik geclustert (Abb. 4D, E, S2). Es wurden fünf kohärente und statistisch unterstützte Gruppen (Cluster) von 40 MAGs identifiziert (Abb. S2). Cluster 1 enthielt ein einzelnes MAG S28, das der Gattung Pseudomonas zugeordnet war (S28, 98 % vollständig, 1,9 % Kontamination, 98,8 % durchschnittliche Nukleotididentität mit P. ceresai GCA_900074915.1)39 und seine Gene wurden zu Beginn der Saison (2017) angereichert. aber der MAG war die ganze Saison über aktiv. Die anderen vier Cluster enthielten zahlreiche MAGs und waren relativ dynamischer, mit Tendenzen zur Anreicherung der Transkripte in der Spätsaison. Mehrere Cluster enthielten MAGs, die derselben Klasse zugeordnet waren, was auf taxonomische Kohärenz bei saisonalen Aktivitäten hindeutet. Cluster 3 umfasste beispielsweise alle bis auf einen (von acht) Actinomycetia-MAGs.

Es überrascht nicht, dass die häufigsten Subsysteme, die unter den 40 fokalen MAGs identifiziert wurden, mit dem Bakterienwachstum in Zusammenhang standen, wie z. B. Kohlenhydrat-, Energie-, Aminosäure- und Nukleotidstoffwechsel (Abb. 5). Blattmetatranskriptome zeigten auch, dass die meisten Subsystem-Transkripte im Laufe der Saison stetig angereichert waren (15/21 Subsysteme waren signifikant erhöht; p-Wert <0,05, Tabelle S2). Die meisten Transkripte nahmen im Laufe der Saison zu, mit einigen Ausnahmen, darunter solche, die mit der Kolonisierung in Zusammenhang standen. Eine genauere Untersuchung der Funktionen, die im Laufe der Saison tendenziell abnahmen, ergab, dass sie fast ausschließlich MAG S28 zugeschrieben werden konnten (dem einzigen Mitglied in Cluster 1 und am engsten mit Pseudomodales assoziiert, Abb. S3 und S4). Schließlich waren einige KEGG-Klassifikationen relativ stabil und es fehlten insgesamt signifikante saisonale Trends, einschließlich Transkripten für Zellmotilität, antimikrobielle Resistenz, Anpassung, Signaltransduktion und Translation.

Die y-Achse wird für jede Klassifizierung skaliert. Die Probengrößen sind in Tabelle 1 angegeben und umfassten 22 bzw. 56 Metatranskriptome für Rutenhirse in den Jahren 2016 und 2017. Die Daten werden als Mittelwerte +/− Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In mindestens 39 der 40 MAGs wurden insgesamt 124 unterschiedliche funktionelle Rollen identifiziert (Abb. S5). Diese funktionellen Rollen waren im Allgemeinen breit gefächert und mit der Translation (n = 48/124), dem Energiestoffwechsel (n = 29/124) und dem Kohlenhydratstoffwechsel (n = 28/124) verbunden. Es gab auch mehrere funktionelle Rollen, die mit Cofaktoren und Vitaminen verbunden waren (n = 18/124). Während viele Funktionen in der Spätsaison (Juli-September) im Vergleich zur Saison (Mai-Juni) in den Transkripten angereichert wurden, stachen drei funktionale Rollen besonders durch Anreicherungen um mehr als das 20-fache in den Transkripten der Spätsaison hervor. Zu diesen drei funktionellen Rollen gehörten Proteine, die als kurzkettige Dehydrogenase, Molybdopterinoxidoreduktase und Polyketidcyclase klassifiziert wurden (Tabelle 2, Abb. S5).

Anschließend führten wir metabolische, biosynthetische und pflanzenassoziierte Genpfadanalysen durch, um die Funktionen der fokalen MAGs in der Phyllosphäre und ihre Aktivitäten zu verstehen, die durch die Rekrutierung von Transkripten in den Pfaden abgeleitet wurden (Abb. 6). Wir stellten die Hypothese auf, dass einige der zwischen Bakterienpopulationen gemeinsamen Wege Funktionen für die Fitness auf dem Blatt darstellen könnten. Wege für den Terpenstoffwechsel (34/40), die Betainbiosynthese (30/40), den Trehalosestoffwechsel (25/40), den Cyanidabbau (21/40), den ROS-Abbau (23/40) und den Abbau von Indolessigsäure (IAA). (40/40) waren die am häufigsten von MAGs gemeinsam genutzten und aktiven Pfade und wurden in Abstammungslinien aller vier Klassen gefunden, die durch die fokalen MAGs repräsentiert werden. Daher sind diese Wege wahrscheinlich bei Mitgliedern der Phyllosphäre verbreitet und unterstützen einen blattassoziierten Lebensstil in hohem Maße. Darüber hinaus gab es einige Funktionswege und Aktivitäten, bei denen es sich möglicherweise um spezialisiertere Funktionen handelt, da sie nur in wenigen MAGs nachgewiesen wurden (z. B. Xylitol-Metabolismus). Es gab jedoch kein klares phylogenetisches Muster für die Verteilung dieser mutmaßlichen Spezialfunktionen.

Funktionelle Genpfade wurden mithilfe von antiSMASH für biosynthetische Gencluster, Gapseq für allgemeine Stoffwechselpfade und manueller Auswahl für pflanzenassoziative Funktionen, über die in der Literatur berichtet wird, kuratiert. Pfade, die in den MAGs entdeckt, aber nicht in den Transkripten erkannt wurden, werden durch leere Kreise dargestellt, und Pfade, die in den MAGs erkannt und durch Transkripte kartiert wurden, werden durch ausgefüllte Kreise dargestellt. Farben kategorisieren verschiedene funktionelle Gruppen von Signalwegen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Aufgrund des nahezu allgegenwärtigen Nachweises terpenbezogener biosynthetischer Gene auf den fokalen MAGs untersuchten wir deren Annotationen und Rekrutierung mithilfe von Genfunktionsvorhersagen (d. h. ORFs) genauer, was voraussichtlich die Empfindlichkeit der funktionellen Annotation im Verhältnis zum Stoffwechselweg verbessern würde Tools (z. B. BGC). Wir haben 278 ORFs entdeckt, die mit Terpenannotationen in den Metatranskripten assoziiert sind. Insgesamt folgten diese Terpen-bezogenen Gene dem Trend einer allmählichen Anreicherung im Laufe der Saison (Abb. 7A) und waren in beiden Jahren relativ häufig anzutreffen. Die Unterkategorie mit der höchsten Anreicherung war die Biosynthese des Terpenoid-Rückgrats, die 29 ORFs umfasste. Unter mehreren nachgewiesenen Isopren-Biosynthesegenen war die relativ hohe und saisonale Anreicherung der beiden terminalen Enzyme im Nicht-Mevalonat-Isopren-Biosyntheseweg, der von Bakterien genutzt wird, gcpE und lytB, von Interesse (Abb. 7B und S6). GcpE- und lytB-Gentranskripte wurden in mehr als einem Drittel der MAGs (13/40) nachgewiesen, und dazu gehörten MAGs, die alle drei nachgewiesenen Phyla repräsentierten. Sechs der acht Proteobakterien, die Isopren-Biosynthese-Transkripte rekrutierten, wurden Methylobacterium (alpha) zugeordnet. Die vier Actinomycetia waren phylogenetisch weiter verbreitet und wurden als Gattungen Frigoribacterium M1, Microbacterium M105, Amnibacterium M67 und Pseudokineococcus M86 bezeichnet. Der einzige Bacteroidota, der Isopren-Biosynthese-Transkripte aufwies, war ein Hymenobacter M9. Anschließend untersuchten wir die 40 MAGs auf den Nachweis eines der neun Gene, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie an der bakteriellen Biosynthese von Isopentenyldiphosphat beteiligt sind, einem Vorläufer von Terpenoiden wie Isopren40, und stellten fest, dass bei 29/40 MAGs sechs oder mehr der Gene nachgewiesen wurden und dass alle MAGs hatten mindestens 2 der Gene (Tabelle S3). Der konsistente Nachweis von Genen, die mit Isopren-Signalwegen in diesen MAGs assoziiert sind, die zu >50 % vollständig sind, legt nahe, dass die Biosynthese von Isopren-verwandten Molekülen eine wichtige Blattstrategie von Phyllosphärenbakterien sein könnte. Pseudomonas MAG S28, von dem früher bekannt war, dass es sich um die dominierende Population handelte, die sich früh in der Saison ansiedelte und aktivierte (Abb. 4 und S2), wies zu Beginn der Saison eine hohe Isopren-Biosynthese-Transkriptanreicherung auf, die dann zurückging. Die anderen elf MAGs, die Gene aus Isopren-Biosynthesewegen enthielten, zeigten jedoch in der Spätsaison eine erhöhte Aktivität.

Eine Transkriptdynamik von Switchgrass-Blättern aus den Jahren 2016 (grün, Kreis) und 2017 (blau, Dreieck) der KEGG-Stoffwechselklassifikationen im Zusammenhang mit dem Terpenstoffwechsel. B-Transkripte in MAGs, die mit terminalen Enzymen in der Nicht-Mevalonat-Isopren-Biosynthese, gcpE und lytB, assoziiert sind. MAG-IDs umfassen die vorhergesagte Taxonomie auf Gattungsebene: Methyl = Methylobacterium, Frigor = Frigoribacterium, Pseudokineo = Pseudokineococcus, Microbac = Microbacterium, Amnibac = Amnibacterium, Hymeno = Hymenobacter, Sphingo = Sphingomonas und Pseudo = Pseudomonas. Die Probengrößen sind in Tabelle 1 angegeben und umfassten 22 bzw. 56 Metatranskriptome für Rutenhirse im Jahr 2016 (grüne Kreise) bzw. 2017 (blaue Dreiecke). Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Zurück zu den BGC-Anmerkungen (von antiSMASH, Abb. 6): Die meisten der durch diesen Ansatz entdeckten Terpentranskripte standen im Zusammenhang mit der Pigmentbiosynthese (z. B. Carotinoide). Die zweithäufigste Klasse von BGC-Transkripten auf den fokalen MAGs waren nicht-ribosomale Peptidsynthase (NRPK)-Gene, aber die meisten davon hatten keine zusätzlichen Anmerkungen über die allgemeine Kategorie hinaus. Daher waren die Ergebnisse der ORF-Analyse und des BGC-Nachweises komplementär, insbesondere für Terpen- und Isopren-bezogene Funktionen. Ein weiterer bemerkenswerter BGC-Befund war, dass alle bis auf zwei (von acht) Actinomycetia-MAGs Transkripte für Typ-III-Polyketidsynthasen aufwiesen, während diese BGC-Klasse bei Proteobakterien und Bacteroidota weniger häufig nachgewiesen wurde.

Als nächstes fragten wir, ob diese fokalen MAGs in anderen Pflanzenmetagenomen umfassender nachgewiesen wurden. Da keine Blattmetagenome verfügbar waren, haben wir verwandte Bodenmetagenome aus lokalen Anbausystemen in Michigan und auch aus den öffentlich verfügbaren Daten in der Datenbank „Integrated Microbial Genomes“ (IMG) erhalten, die als Aufbewahrungsort für die Sequenzierungsbemühungen des Joint Genome Institute in den USA dient Energiebehörde. Wir waren überrascht, dass für jedes untersuchte Metagenom Lesevorgänge diesem Satz von MAGs zugeordnet werden konnten. Dazu gehörten Bodenmetagenome von Rutenhirse- und Miscanthus-Feldern an drei Standorten (Iowa, Michigan und Wisconsin), die über fünf verschiedene Jahre hinweg beprobt wurden (Abb. 8). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die entdeckten und analysierten MAGs in Agrarökosystemen des Mittleren Westens weit verbreitet sein können und möglicherweise von allgemeiner Bedeutung für mehrjährige Kulturpflanzenumgebungen sind.

Die Stichprobengröße betrug 55 öffentliche Metagenome. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Hier berichten wir über eine mehrjährige saisonale Metagenom- und Metatranskriptom-Bewertung der Pflanzenphyllosphäre unter landwirtschaftlichen Feldbedingungen, wobei wir uns auf die bakteriellen Funktionen konzentrieren, die mit zwei vielversprechenden Biokraftstoff-Rohstoffen verbunden sind. Wir gehen davon aus, dass diese Erkenntnisse auch für andere Gräser oder Systeme mit beträchtlicher Luftbiomasse, einschließlich einheimischer Prärie, relevant sind. Darüber hinaus umfasste unsere Sammlung von MAGs Phyllosphärenmitglieder, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie in anderen Pflanzen reichlich vorhanden, beständig oder für den Mikrobiomaufbau von Bedeutung sind, einschließlich der Modell-Arabidopsis (z. B. 41, insbesondere: Sphingomonadales, Pseudomonadales, Actinomycetales, Burkholderiales und Rhizobiales). Muster und konsistent erkannte Funktionen in dieser kuratierten Sammlung bieten allgemeine Einblicke sowie saisonale Phyllosphärenfunktionen.

Es gibt mehrere Hinweise darauf, dass die hier besprochenen fokalen MAGs ökologisch wichtige Abstammungslinien in der Phyllosphäre der Rutenhirse und der Miscanthus darstellen. Erstens gibt es eine große Überlappung zwischen diesen fokalen MAGs und den Kerntaxa mit hoher Häufigkeit und Belegung aus unserer vorherigen 16S-rRNA-Gen-Amplikon-Analyse der Diversität der Rutenhirse- und Miscanthus-Phyllosphäre32, einschließlich eines MAG, das mit Hymenobacter M9 assoziiert ist, einer Gattung mit hoher Häufigkeit Belegung über Felder und im Zeitverlauf sowie mehrere zugewiesene OTUs. Dieselbe Zeitreihe wurde in unserer vorherigen Amplikonanalyse untersucht und die Kerntaxa wurden anhand der Konsistenz über replizierte Felder zum gleichen Zeitpunkt, der Persistenz über die Zeit und der relativen Häufigkeit priorisiert. Dies legt nahe, dass es sich bei den durch die MAGs repräsentierten Populationen nicht um seltene Taxa handelt, die für das System vorübergehend sind. Zweitens konnten wir aus den komplexen Metagenomdaten hochwertige Assemblies generieren, ein Prozess, der im Allgemeinen auf reichlich vorhandene Mitglieder ausgerichtet ist. Diese MAGs sind in Metagenomen stark vertreten und rekrutieren auch relativ mehr Metatranskriptom-Reads, was darauf hindeutet, dass sie in der Phyllosphäre sowohl häufig vorkommen als auch aktiv sind. Obwohl es möglich ist, dass in unserer Sammlung weitere, ökologisch wichtige Abstammungslinien fehlen, sind wir zuversichtlich, dass die hier besprochenen Abstammungslinien zu den wichtigsten vom Wirt oder der Umwelt ausgewählten Populationen gehören, die in der Phyllosphäre von Rutenhirse und Chinaschilf leben.

Trehalose ist ein Disaccharid, das Zellen vor Salz-, Wasser- und Osmolytstress schützt, indem es als stabilisierendes chemisches Chaperon dient, indem es entweder Wasser von Proteinoberflächen verdrängt oder Proteinstrukturen umgibt, um sie abzuschirmen42. In ähnlicher Weise ist Betain ein weiteres häufig biosynthetisiertes Osmoschutzmittel, das von Mikroorganismen zur Bekämpfung von Wasser-, Salz- und Temperaturstress eingesetzt wird43. Es wurde angenommen, dass es sich bei beiden um wichtige Überlebensstrategien von Mikroorganismen in der Phyllosphäre handelt, was durch Isolat-Genomanalysen unterstützt wird44. Hier zeigen wir, dass sowohl Trehalose als auch Betain in MAG-Populationen eine herausragende Rolle spielen und konsistent auf der Blattoberfläche aktiviert werden, was darauf hindeutet, dass sie nicht saisonal aktiviert werden, sondern vielmehr für den blattassoziierten Lebensstil notwendig sind.

In Bakterien verhindert der Trehalose-Stoffwechsel den zellulären Überlaufstoffwechsel und Kohlenstoffstress, indem er die Umwandlung von Glucose-6-phosphat in Pyruvat umleitet42. Die Trehalose-Biosynthese kommt häufig bei Bakterien und Archaeen vor, die in ariden, salzhaltigen, thermischen oder saisonal trockenen Umgebungen leben (z. B. 45, 46, 47), und es wurde auch berichtet, dass sie in einer Pseudomonade durch Ethanol induziert wird, das aus dem Inneren der Pflanze stammen kann Zellen49 oder allgemeiner in den Wurzeln (z. B.50), insbesondere bei Stress, Fruchtreife oder Seneszenz51. In Rutenhirsen und Pflanzen im Allgemeinen ist die Trehalosekonzentration als Reaktion auf Dürrebedingungen erhöht52 und ihre Vorstufe, Trehalose-6-phosphat, induziert Seneszenz, wenn Kohlenstoff leicht verfügbar ist53. Darüber hinaus wurde berichtet, dass das A. thaliana-Phyllosphärenmitglied Sphingomonas melonis die Trehalose-Biosynthese unter Wachstumsbedingungen reguliert, die leichten Stress begünstigen54. Vor diesem Hintergrund ist es sinnvoll, dass die meisten MAGs eine Anreicherung von Transkripten im Zusammenhang mit dem Trehalose-Metabolismus aufwiesen, was einen pflanzenassoziierten Lebensstil während Dürre und Seneszenz des Wirts unterstützen würde54.

Die Betain-Biosynthese in Bakterien beginnt oft mit der Oxidation von Cholin, das Teil des Pflanzengewebes ist und in die Zelle transportiert werden kann55. Tatsächlich wurde hier in 9/10 Gammaproteobakterien-MAGs ein Cholinabbau festgestellt (Abb. 6). Mikrobielle Osmolyte wie Betain und Trehalose wurden als Ziele für die biotechnologische Entwicklung vorgeschlagen, um die Stresstoleranz von Pflanzen zu unterstützen. Pflanzen können jedoch Betain biosynthetisieren und können in Gruppen eingeteilt werden, die Betain in Konzentrationen anreichern, die die Stresstoleranz unterstützen, und solche, die es nicht anreichern56. Beispielsweise war in Rutenhirse die Konzentration von Glycinbetain nicht aussagekräftig für Unterschiede in der Dürretoleranz zwischen verschiedenen Genotypen, während dies bei Trehalose zusammen mit Abscisinsäure, Spermin und Fructose der Fall war52. Darüber hinaus deuten unsere Daten auf keine nennenswerten mikrobiellen Einschränkungen des genetischen Potenzials oder der Aktivierung der Betainbiosynthese in der Phyllosphäre hin.

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) dienen als Signale für verschiedene Entwicklungs- und Zellprozesse in Pflanzen, und hier haben wir in den meisten fokalen MAGs aktive Wege für den ROS-Abbau entdeckt. Obwohl die genauen Mechanismen unklar sind, wird erwartet, dass die Homöostase von ROS an der Seneszenz beteiligt ist, was für unsere Studie relevant ist, da an den Probenahmeterminen im August bzw. September zumindest einige bis die meisten seneszierenden Pflanzen pro Parzelle beobachtet wurden. Darüber hinaus reichern sich ROS in Pflanzen an, die abiotischem Stress ausgesetzt sind, was negative Auswirkungen hat. Der ROS-Abbau ist eine von vielen Funktionen, die Phyllosphären-Mikroorganismen einsetzen, um mit den erwarteten Schwankungen der ROS auf der Blattoberfläche umzugehen (obwohl diese Flüsse schwer zu messen sind57). Zuvor wurden mehrere Gene, die für die Reaktion auf oxidativen Stress relevant sind, in einem Wildtyp-Phyllosphärenbakterium, Sphingomonas melonis-Stamm Fr1, unterschiedlich reguliert, im Vergleich zu einer Knock-out-Mutante zur Regulierung der allgemeinen Stressreaktion, wenn beide in einem Medium gezüchtet wurden, von dem erwartet wurde, dass es geringe Konzentrationen von oxidativem Stress induziert Stress54. Angesichts der Tatsache, dass der Umgang mit pflanzlichen ROS ein Ziel zur Reduzierung von Pflanzenstress und zur Regulierung der Pflanzenentwicklung ist57,58, ist es möglich, dass die Manipulation des mikrobiellen ROS-Abbaus als ein Instrument zur Erreichung solcher Bemühungen eingesetzt werden könnte, aber es bedarf noch viel weiterer Forschung, um den mikrobiellen Wirt zu verstehen Interaktion bei ROS-Exposition oder -Akkumulation und jegliche mögliche ROS-Signalisierung zwischen ihnen.

IAA ist ein Phytohormon, das von Pflanzen produziert wird, um viele Wachstumsprozesse und Stressreaktionen zu regulieren (z. B. 59,60). Es wird auch von vielen Mikroorganismen hergestellt, darunter auch solchen, die nachweislich das Pflanzenwachstum fördern (z. B. 60). Angesichts der Redundanzen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen bei der Synthese und Reaktion auf IAA wird daher die Aktivität von IAA-Abbauwegen durch fokale MAGs erwartet und zeigt die Reaktionsfähigkeit des Mikrobioms auf Rückmeldungen in der Wirtsumgebung.

Die meisten der in unseren MAGs identifizierten Funktionen deuten auf allgemeine Anforderungen an Wachstum und Erhaltung bei einem blattassoziierten Lebensstil hin (z. B. Kohlenhydrat- und Aminosäurestoffwechsel, Pigmentproduktion zum Schutz vor Strahlung, ähnlich wie in früheren Berichten, z. B. 61). Allerdings BGC-Analyse ergab eine überraschende Konsistenz in den Stoffwechselwegen von Terpenen, was uns dazu veranlasste, die mit Terpenen verbundenen Transkript-ORFs genauer zu betrachten. Diese Analyse ergab eine besondere Anreicherung der Wege und Gene, die mit der Isoprenoid-Biosynthese verbunden sind. Isoprenoide sind eine Klasse flüchtiger Terpene, die im Allgemeinen reichlich vorhanden und reaktiv sind Sie gehen eine indirekte und komplexe Rückkopplung mit den Treibhausgasen Methan und Lachgas ein62. Isopren ist eines der einfachsten Isoprenoide. Es wird von vielen Pflanzenarten freigesetzt und ein Großteil davon wird im Methylerythritolphosphat-Weg des Chloroplasten synthetisiert (MEP, auch bekannt als: Nicht-Mevalonat)63. Es wird angenommen, dass Isopren als Signalmolekül bei der Stressreaktion fungiert.64. Studien haben auch ergeben, dass die Isoprenemission die Photosynthese der Blätter vor kurzen Episoden hoher Temperaturen schützt65. Pflanzen emittieren Isopren aus reifen, photosynthetisch aktiven Blättern, und die Emissionen reagieren auf Licht63. Es wurde jedoch berichtet, dass die Isopren-Emissionen seneszierender Blätter im Vergleich zu ihren Blättern bei maximalem Wachstum abnehmen66. Es wurde berichtet, dass sowohl Rutenhirse als auch Chinaschilf relativ geringe Grundwerte an Isopren ausstoßen67,68.

Wir spekulieren, dass Mitglieder der Bakteriengemeinschaft der Biokraftstoff-Rohstoffe in der Phyllosphäre entweder den Verlust von pflanzlichem Isopren kompensieren, sich an der Interspezies-Isoprenoid-Signalisierung mit dem Wirt beteiligen, die Photosynthese der Pflanzen vor thermischen Schäden schützen, reaktive Sauerstoffspezies löschen oder möglicherweise Isoprenoide produzieren Überlaufmetaboliten (wie für Bacillus subtilus angenommen69). Bakterielle Isoprenabbauer und -synthetisierer sind in der Natur weit verbreitet62 und wurden zuvor in Phyllosphärengemeinschaften des relativ hohen Isoprenemittenten Populus spp70 sowie in Böden71, die als Isoprensenke dienen können, untersucht. Stabile Isotopentests wurden verwendet, um festzustellen, dass eine Untergruppe von Mitgliedern der Bakteriengemeinschaft Isopren abbaut, darunter mehrere Actinobakterien (Rhodococcus spp.) und Variovorax (Proteobakterien)70,71. Unsere MAG-Sammlung enthält mehrere Actinomycetia, ein Hymenobacter, mehrere Methylobacterium und Pseudomonas MAG S28, die eine Aktivierung von Genen zeigen, die an der Isoprenoid-Biosynthese beteiligt sind, und ihre Beteiligung an verwandten molekularen Rückkopplungen in der Phyllosphäre unterstützen. Da diese Aktivitäten außerdem in drei Bakterienstämmen nachgewiesen wurden, deutet dies darauf hin, dass die Biosynthese von Isopren-verwandten Molekülen eine sehr häufige Funktion des Phyllosphären-Mikrobioms sein könnte. Da Isopren ein Vorläufer von Seitenketten ist, die für mehrere Chinone benötigt werden72, könnte man spekulieren, dass Blattbakterien das von der Wirtspflanze abgegebene Isopren abfangen, um die bakterielle Synthese dieser Seitenketten zu ergänzen, dies jedoch durch eine De-novo-Biosynthese kompensieren, wenn der Wirt die Produktion verringert. Wir beobachten, dass die Isoprenoidsynthese in den meisten MAGs, die diese Wege enthalten, saisonal zunimmt und gleichzeitig damit zu rechnen ist, dass auch die pflanzlichen Isoprenemissionen abnehmen. Dies ist die Grundlage für zukünftige Arbeiten, um diese Dynamik und die potenzielle Isoprenoid-vermittelte Interaktion zwischen Bakterien und Wirt zu verstehen.

Wir heben drei MAG-Populationen hervor, die aufgrund ihrer Taxonomie, Funktion, Dynamik oder Belegung von Interesse waren. Alle wurden in unserer vorherigen 16S-rRNA-Umfrage mit Taxa geteilt, was ihre Aufnahme als Teil des „Kernsatzes“ unterstützt, der nach Häufigkeit und Belegung ausgewählt wurde. Erstens war hochwertiges MAG S28 (>97 % vollständig, <2 % Kontamination) ein prominenter Pionier und aktiver Besiedler des Blattes (Abb. 4, S2-Gruppe 1). MAG S28 ist mit Pseudomonas cerasi verwandt, einer Art, von der berichtet wird, dass sie Phytopathogen-Verwandte hat73, wir haben jedoch keine Krankheitssymptome auf den analysierten Blättern festgestellt. Diese Population hatte Merkmale eines starken Oberflächenbesiedlers erwartet, einschließlich Kolonisierungs-, Anpassungs- und Motilitätssubsystemen. Es gab auch sechs Wege im Zusammenhang mit Phytohormonreaktionen (von insgesamt sieben in diesen Daten beobachteten Phytohormonwegen), darunter aktivierte Ethenbiosynthese, ACC-Deaminase und den Abbau von Ethylenglykol, Putrescin, Salicylat und IAA. Diese Daten legen nahe, dass S28 über mehrere Mechanismen verfügt, um über Phytohormone mit dem Wirt in Kontakt zu treten oder auf ihn zu reagieren.

Als nächstes war MAG M9, identifiziert als Hymenobacter, von Interesse, da es mit der zahlreichsten taxonomischen Gruppe assoziiert war, die in unserer vorherigen 16S-rRNA-Genuntersuchung32 entdeckt wurde, und nicht zu den am häufigsten untersuchten Phyllosphärenlinien in der Literatur gehörte. Während M9-Populationen erstmals zu Beginn der Saison entdeckt wurden, wurden ihre Transkripte in der Spätsaison angereichert (Abb. 4 und S2-Gruppe 5). MAG M9 hatte Galactonat-, N-Acetylglucosamim- und Laktosestoffwechsel entdeckt und aktiviert, die bei den fokalen MAGs nicht üblich waren. Es hatte auch einen aktivierten Benzoat-, Curcumin- und Putrescin-Abbau sowie eine Cyanid-Entgiftung, Typ-VI-Sekretion und Diwasserstoffoxidation. Während M9 auch über einige Wege verfügte, die bei diesen MAGs üblich waren (z. B. ROS- und IAA-Abbau, Terpen-Biosynthese), deuten seine weniger nachgewiesenen Wege und Funktionen auf eine spezielle Rolle in der Phyllosphärengemeinschaft hin. Bemerkenswert ist, dass M9 zu 65 % abgeschlossen ist und 0 % Kontamination festgestellt wurde, was darauf hindeutet, dass für diese und ähnliche Hymenobacter-Linien, die in der Phyllosphäre leben, noch weiteres funktionelles Potenzial entdeckt werden muss.

Schließlich wählten wir ein repräsentatives Actinomycetia MAG M60 aus, eine Quadrisphaera-Linie, die die Isoprenoid-Biosynthese aktiviert hatte und spät in der Saison eine erhöhte Aktivität aufwies, zusammen mit den meisten fokalen MAGs (Abb. 4 und S2 Gruppe 3). Studien haben ergeben, dass Mitglieder der Actinomycetia ein wichtiger Teil der Phyllosphäre sind, der zur Krankheitsprävention und zum Pflanzenwachstum beiträgt74,75,76. MAG M60 hatte mehrere Oligo-/Polysaccharid-Metabolismen, die in diesen Daten selten nachgewiesen wurden, darunter Glykogen, Melibiose und Trehalose. Trotz seiner hohen Vollständigkeit und geringen Kontamination (> 95 % bzw. < 5 %) wurde M60 durch die von uns angewandten Methoden nur spärlich annotiert. Es wurde jedoch berichtet, dass Quadrisphaera-Taxa in der Phyllosphäre oder Endosphäre verschiedener Pflanzen sehr häufig vorkommen77.

In vielen neueren Übersichtsartikeln, Perspektiven und Meinungsbeiträgen wird die Integration von Multi-Omics-Ansätzen gefordert, um das Verständnis des Mikrobioms und seiner Beziehung zur Wirtspflanze zu verbessern44,78,79,80,81. Die meisten integrativen Studien haben sich jedoch fast ausschließlich auf die Rhizosphäre als den Bereich der Boden-Pflanzen-Rückkopplungen und der Nährstoff- und Wasseraufnahme für den Wirt konzentriert. Obwohl Blätter für die Probenahme leicht zugänglich sind, ist die Untersuchung des Phyllosphären-Mikrobioms mit kultivierungsunabhängigen Durchsatzansätzen wie Metagenomik und Metatranskriptomik schwierig. In Blattproben gibt es ein hohes Maß an Wirts- und Chloroplastenkontamination und eine relativ geringe mikrobielle Biomasse pro Blatt, die zunächst von fest anhaftenden Biofilmen entfernt werden muss. Ein Signal von Messenger-RNA in der Metatranskriptomanalyse wird durch ein reichlich vorhandenes ribosomales RNA-Signal maskiert, was zu weiteren Herausforderungen führt. Diese beiden Herausforderungen führen zu einem relativ geringen Anteil nutzbarer Sequenzen im Verhältnis zum gesamten Sequenzierungsaufwand (nach Qualitätsfilterung des Nichtzielsignals) für Blattmikrobiomstudien, was auch in dieser Arbeit zutraf und eine Einschränkung darstellt. Aufgrund der Kombination all dieser Herausforderungen haben wir einen Großteil unseres Verständnisses der Phyllosphäre als der größten Fläche mikrobieller Lebensräume auf der Erde26 aus Studien gewonnen, in denen Modellwirte und synthetische oder modellierte mikrobielle Gemeinschaften in kontrollierten Umgebungen eingesetzt wurden Beschreibung der Gemeinschaftsstruktur durch Sequenzierung von Markergenen, amplifiziert und bioinformatisch von Chloroplastengenen befreit, um die Herausforderungen von schwachem Signal und Wirtskontamination zu bewältigen.

Hier berichten wir über optimierte Laborprotokolle (zur Minimierung von Wirts- und Chloroplastensignalen) in Kombination mit einem genomzentrierten bioinformatischen Ansatz zur Durchführung einer fokussierten funktionellen Gen- und Transkriptanalyse saisonal dynamischer, aber persistenter Mitglieder des Phyllosphären-Mikrobioms. Bei unserer Arbeit handelt es sich um eine ungezielte bakterielle metatranskriptomische Arbeit, die an der Blattphyllosphäre von Feldfrüchten durchgeführt wird. Andere neuere Blattmetatranskriptomstudien konzentrierten sich auf die Virusgemeinschaften von Tomaten und Paprika82, Sojabohnen83 und Reis84. Eine wesentliche Stärke dieser Arbeit ist die anspruchsvolle Integration von Metagenom- und Metatranskriptomdaten der Phyllosphäre, wobei die höhere Abdeckung der Metagenome mit den aus den Metatranskriptomen verfügbaren Aktivitätsinformationen genutzt wird. Trotz der relativ begrenzten Abdeckung der MAGs (aufgrund der erheblichen Wirts- und ribosomalen DNA-Kontamination) erwies sich die Analyse durch die Integration beider Datensätze und den Fokus auf die genomzentrierte Interpretation als erfolgreich. Daher gibt es wahrscheinlich viel mehr vorherrschende und funktionell aktive Populationen der Phyllosphäre, die in dieser Studie nicht erfasst wurden, einschließlich der Akteure, von denen bekannt ist, dass sie eine Schlüsselrolle in der Phyllosphäre spielen (z. B. 20, 85). Erheblicher zusätzlicher Sequenzierungsaufwand oder eine Anreicherungsstrategie würden das Signal für einen kultivierungsunabhängigen Ansatz zur gezielten Ansprache dieser Akteure verbessern. Während die Verwendung genomzentrierter Ansätze den offensichtlichen Nachteil hat, dass wir offensichtlich nicht jedes Mikrobiommitglied erfasst haben, ermöglicht uns unser Ansatz, aktiv transkribierte Funktionen mit bestimmten mikrobiellen Mitgliedern zu verknüpfen. Darüber hinaus sind die hier dokumentierten funktionellen Gene und Aktivitäten angesichts des aktuellen Verständnisses der mikrobiellen Anpassung an die Wirts- und Phyllosphärenumgebung logisch.

Insgesamt liefert diese Arbeit Belege für ein gedeihendes, dynamisches, funktionell vielfältiges, auf Blätter spezialisiertes und auf den Wirt reagierendes Mikrobiom in der Phyllosphäre mehrjähriger Gräser. Es liefert Hinweise auf spezifische Phyllosphärenfunktionen, die in einem gemäßigten Agrarökosystem saisonal aktiviert werden, und legt mehrere Hypothesen über wichtige Wirt-Mikroben-Interaktionen in der Phyllosphäre nahe, beispielsweise über den Zentralstoffwechsel, die Isoprenoid-Biosynthese und Stressreaktionen. Diese Forschung trägt zu unserem umfassenden Verständnis der Dynamik und Aktivitäten mikrobieller Gemeinschaften in der Phyllosphäre bei und weist auf spezifische mikrobielle Funktionen hin, auf die es abzuzielen gilt und die sich für das Pflanzen-Mikrobiom-Management als nützlich erweisen könnten.

Rutenhirse- und Miscanthus-Blätter sowie entsprechende Kontextdaten wurden am Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) an der Kellogg Biological Station (KBS) in Hickory Corners, MI, USA (42o23'41,6" N, 85o22'23,1" W) gesammelt. An den Standorten des GLBRC Biofuel Cropping System Experiment (BCSE) werden innerhalb der Parzellen die Parzellen 1–4 gemäß dem Standortprotokoll wiederholt. Dazu gehörte das Gehen entlang eines Transekts und das Anhalten an vorher festgelegten Probenahmestationen, die zufällig innerhalb der Felder angeordnet waren, um die Ernte möglichst wenig zu stören (Abb. 1). Wir beprobten Rutenhirse (Panicum virgatum L. Sorte Cave-in-rock) und Chinaschilf (Miscanthus x giganteus), indem wir im Jahr 2016 zu acht bzw. neun Zeitpunkten Blätter sammelten, und für Rutenhirse zu sieben Zeitpunkten in der Saison 2017 (Tabelle 1). , Abb. 1, Ergänzende Daten 1, Ergänzende Daten 2). Wir haben im Jahr 2016 zu drei phänologisch fundierten Switchgrass-Zeitpunkten (Auflaufen, Spitzenwachstum und Seneszenz) Blätter für die RNA-Isolierung gemäß den GLBRC-Standard-Phänologiemethoden [https://data.sustainability.glbrc.org/protocols/165] gesammelt, um sie zu bewerten Das Potenzial für eine ausreichende Massen- und Qualitäts-RNA-Extraktion aus der Blattoberfläche der Rutenhirse wurde im Jahr 2017 auf Blätter aller Rutenhirse-Probenahmezeitpunkte ausgeweitet. Blätter für die RNA-Isolierung wurden sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verarbeitung bei –80 °C gelagert.

Phyllosphären-Epiphyten-DNA wurde isoliert und verarbeitet32. Für diese Studie wurden die gleichen Phyllosphärenproben und extrahierten Nukleinsäuren verwendet wie für Grady et al. 2019 (16S rRNA-Amplikonanalyse) und für Bowsher et al. 2020 (ITS-Amplikonanalyse). Die DNA-Konzentrationen wurden auf 4 ng/ul normalisiert. Phyllosphären-Epiphyten-RNA wurde mithilfe einer Benzylchlorid-Flüssigkeit isoliert: Flüssigextraktion, basierend auf32, die für die RNA-Isolierung basierend auf den veröffentlichten Methoden von86 neu modifiziert wurde. Ungefähr 5 g intaktes, gefrorenes Blattmaterial wurden in ein konisches 50-ml-Polypropylenröhrchen (Corning Nr. 430290) gegeben und auf flüssigem Stickstoff gefroren gehalten, während die Proben gewogen und transferiert wurden. Denaturierungslösung (DS) wurde mit 4,2 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat-Dihydrat pH 7,0, 0,5 % (v/v) Natrium-n-lauroylsarcosin in Milli-q-Wasser hergestellt und durch 0,22-mm-Filter filtersterilisiert. Unmittelbar vor der Extraktion wurde ein DS-Arbeitsvorrat frisch durch Zugabe von 2-Mercaptoethanol bis zu einer Endkonzentration von 5 % (v/v, DS/2-ME) hergestellt. Zu jedem Blattröhrchen wurden 5 ml Benzylchlorid, 2,5 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 5 ml der Arbeitslösung DS/2-ME gegeben. Das Röhrchen wurde 20 Minuten lang in einem 60 °C warmen Wasserbad inkubiert, wobei alle 1 Minute vortexiert wurde. Die Blätter wurden mit einer mit Ethanol sterilisierten Pinzette aus dem konischen Röhrchen entfernt und entsorgt.

Der verbleibenden Lösung in jedem konischen Röhrchen wurden fünf ml Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) zugesetzt, die Lösung wurde dann 15 Sekunden lang von Hand geschüttelt und 15 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Röhrchen wurden dann 15 Minuten lang bei 4 ° C und 12.000 × g zentrifugiert, um wässrige und organische Phasen zu trennen. Bis zu 5 ml der oberen wässrigen Phase wurden in ein sauberes 15-ml-Polypropylenröhrchen überführt, ohne die weiße Grenzfläche zu zerstören. Zweieinhalb ml Natriumcitratpuffer (1,2 M Natriumchlorid, 0,8 M Natriumcitrat-Dihydrat in Milli-q-Wasser, Filter sterilisiert bei 0,22 mm) und eiskaltes Isopropanol wurden hinzugefügt, um ein Endvolumen von 12,5 ml zu erreichen. Anschließend wurden die Röhrchen 15 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert, um die RNA zu pelletieren, und der verbleibende Überstand wurde mit einer Pipette abgesaugt. Die RNA-Pellets wurden in 0,3 ml DS/2-ME-Arbeitslösung resuspendiert und anschließend wurden 0,3 ml eiskaltes Isopropanol hinzugefügt und durch vorsichtiges Pipettieren gemischt. Die Lösung wurde 30 Minuten lang bei –20 °C inkubiert, und dann wurde das gesamte Volumen in ein sauberes, nukleasefreies 1,7-ml-Röhrchen überführt und 15 Minuten lang bei 4 °C und 16.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 1 ml nukleasefreiem 75 %igem Ethanol gewaschen. Anschließend wurden die Röhrchen 15 Minuten lang bei 4 ° C und 16.000 × g zentrifugiert und der Überstand erneut mit einer Pipette entfernt. Das verbleibende Pellet wurde an der Luft getrocknet, um restliches Ethanol vollständig zu entfernen, und dann in 30 ml nukleasefreiem Tris-EDTA-Puffer, pH 8,0, resuspendiert.

Genomische DNA (gDNA) wurde mit RNase-freier DNase I (Thermo Fisher #AM2222) gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernt. Anschließend wurde die RNA mit dem RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen Germantown, MD, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Das Fehlen kontaminierender gDNA wurde durch die fehlende Amplifikation der 16S-rRNA-Gen-V4-Region durch PCR87 mit Positiv- und Negativkontrollen bestätigt. Diese RNA-Isolierungsmethode wurde so entwickelt, dass sie möglichst eng mit unserer etablierten Phyllosphären-Epiphyten-DNA-Isolierung32 übereinstimmt, um potenzielle Verzerrungen zu minimieren, die bei der Zerstörung des Biofilms oder der Lyse mikrobieller Zellen entstehen, und um die Kontamination durch Wirts-RNA oder genomische DNA zu minimieren, indem das Pflanzengewebe intakt bleibt. Kommerzielle RNA-Extraktionskits basieren in erster Linie auf dem Mahlen oder Schlagen ganzer Gewebeproben, was zu einer erhöhten Überrepräsentation von vom Wirt stammenden Nukleinsäuren führen und möglicherweise zu einer Verzerrung der Effizienz der mikrobiellen Zelllyse führen würde.

Das Joint Genome Institute (JGI) führte die Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung der eingereichten RNA- und DNA-Proben durch. Die plattenbasierte DNA-Bibliotheksvorbereitung für die Illumina-Sequenzierung wurde auf dem PerkinElmer Sciclone NGS-Roboter-Liquid-Handling-System unter Verwendung des Kapa Biosystems-Bibliotheksvorbereitungskits durchgeführt. 1,82 ng Proben-DNA wurden mit einem Covaris LE220 fokussierten Ultraschallgerät auf 436 bp geschert. Die gescherten DNA-Fragmente wurden durch Doppel-SPRI nach ihrer Größe selektiert, und dann wurden die ausgewählten Fragmente am Ende repariert, mit einem A-Schwanz versehen und mit Illumina-kompatiblen Sequenzierungsadaptern von IDT ligiert, die einen eindeutigen Molekularindex-Barcode für jede Probenbibliothek enthielten. Die vorbereiteten Bibliotheken wurden mit dem qPCR-Kit für Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation von KAPA Biosystems quantifiziert und auf einem Roche LightCycler 480 Echtzeit-PCR-Gerät ausgeführt. Die Sequenzierung der Durchflusszelle wurde auf dem Illumina HiSeq 2500-Sequenzer nach einem 2 × 151 indizierten Laufrezept durchgeführt.

Am JGI wurde die plattenbasierte RNA-Probenvorbereitung auf dem PerkinElmer Sciclone NGS-Roboter-Liquid-Handling-System unter Verwendung des Illumina Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Bacteria) und des TruSeq Stranded Total RNA HT-Probenvorbereitungskits gemäß dem von Illumina in ihrem Benutzerdokument beschriebenen Protokoll durchgeführt Leitfaden: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseqstranded-total-rna.html und mit den folgenden Bedingungen: Gesamt-RNA-Ausgangsmaterial von 100 ng pro Probe und zehn PCR-Zyklen für die Bibliotheksamplifikation. Die vorbereiteten Bibliotheken wurden mit dem qPCR-Kit für Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation von KAPA Biosystems quantifiziert und auf einem Roche LightCycler 480 Echtzeit-PCR-Gerät ausgeführt. Die Sequenzierung der Durchflusszelle wurde unter Verwendung eines RNASeq-Protokolls mit geringem Input und rRNA-Depletion auf dem Illumina NovaSeq 6000-Sequenzer mit NovaSeq XP V1-Reagenzienkits und einer S4-Durchflusszelle nach einem 2 × 151 indizierten Laufrezept durchgeführt.

Wir fuhren mit der bioinformatischen Analyse (Abb. 2) von 192 Metagenom- (Ergänzungsdaten 1) und 78 Metatranskriptom- (Ergänzungsdaten 2) Beobachtungen fort, die den JGI-Standards für die Rohdatenqualität auf der Grundlage der proprietären Illumina-Software entsprachen. Wir haben Trimmomatic (v0.39)88 verwendet, um Adapter zu entfernen und minderwertige Lesevorgänge aus Fastq-Dateien mit den folgenden Argumenten zu filtern: PE -phred33 ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10:8:TRUE LEADING: 3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36. Nach dem Zusammenbau wurden die Lesevorgänge des Pflanzenwirts herausgefiltert (sowohl für Metagenome als auch für Metatranskriptome), indem alle Lesevorgänge entfernt wurden, die dem Rutenhirse-Genom zugeordnet waren (Panicum virgatum v1.0, DOE-JGI, http://phytozome.jgi.doe.gov/). oder Miscanthus-Genom (Miscanthus sinensis V7.1 http://phytozome.jgi.doe.gov/) unter Verwendung von Bowtie2 (Version 2.4.1), Samtools (Version 1.13) und Bedtools (Version 2.30.0)89,90,91 ( Abb. S1). Um die Pilz-Reads zu entfernen und das prokaryotische Signal in Metagenomproben zu verbessern, haben wir die Reads auch anhand von sieben Pilzgenomen gefiltert92,93,94,95, die nahe Verwandte der am häufigsten vorkommenden Pilzarten in diesem System darstellen, die wir in unserer früheren Arbeit bewertet und berichtet haben96 (Tabelle S1). Die Genome dieser Pilzarten wurden aus dem JGI-Genomportal oder der GenBank abgerufen.

Zwei Metagenom-Assemblys, eine für Rutenhirse und eine für Miscanthus, wurden auf der Grundlage der 2016 gesammelten Metagenome erstellt. Diese gefilterten Metagenom-Reads wurden kombiniert und für die Co-Assemblierung (Co-Assemblierung nach Kultur im Jahr 2016) mit MEGAHIT (Version 1.2.9) verwendet. using--kmin-1pass (geringe Sequenzierungstiefe) und --presets meta-large (komplexes Metagenom)97. Darüber hinaus haben wir mithilfe von Metabat (v2.2.15)98 metagenomassemblierte Genome (MAGs) aus den Switchgrass- und Miscanthus-Metagenombibliotheken von 2016 (n = 136 Metagenome) wiederhergestellt. MAG-Assemblierungen wurden mithilfe gefilterter Messwerte von Rutenhirse und Chinaschilf durchgeführt, die im Jahr 2016 separat beprobt wurden, um die Vollständigkeit und Zuverlässigkeit zu maximieren, wie dies auch in anderen Studien durchgeführt wurde99. Um die Qualität und Vollständigkeit der MAGs zu beurteilen, verwendeten wir CheckM (v.1.13 mit der Option lineage_wf)100. Unter insgesamt 238 MAGs, die aus den Metagenomen der Switchgrass- oder Miscanthus-Phyllosphäre zusammengestellt wurden (Ergänzungsdaten 3), haben wir eine Untergruppe von MAGs ausgewählt, basierend auf: Vollständigkeit größer als 50 % und Kontamination weniger als 10 %. Wir haben mit dRep (v3.2.0, Olm et al. 2017) replizierte Bins identifiziert, die mit MAGs verbunden sind, was zur Entfernung eines einzelnen MAG führte. Ein zusätzlicher MAG wurde aufgrund unzureichender Leserekrutierung in Metatranskriptomen (unten beschrieben) für insgesamt 40 fokale MAGs entfernt, darunter sieben hochwertige und 33 mittlere Qualität38 (Ergänzungsdaten 3).

Die Read-Rekrutierung wurde für die 40 fokalen MAGs38,101 durchgeführt. Die Metagenomhäufigkeit von Contigs in MAGs in jeder Probe wurde auf der Grundlage der mittleren Abdeckung der gefilterten Metagenomablesungen geschätzt, die mit jedem MAG-Contig verbunden sind. Insbesondere wurde Bowtie2 (v2.2.2) verwendet, um Lesevorgänge an allen MAG-Contigs im Fokus auszurichten (unter Verwendung der Standardeinstellung und der Möglichkeit, dass ein einzelner Lesevorgang nur einer Referenz zugeordnet werden kann). Bedtools (v2.28) wurde verwendet, um die Abdeckung jedes Basenpaars innerhalb des Contigs abzuschätzen. Die geschätzte Häufigkeit eines Contigs basierte auf der mittleren Basenpaarabdeckung aller dem Contig zugeordneten Lesevorgänge, und die geschätzte Häufigkeit eines MAG basierte auf der durchschnittlichen mittleren Abdeckung aller Contigs innerhalb seiner Behälter (Ergänzungsdaten 4). Die Metatranskriptomhäufigkeit wurde anhand der in MAGs identifizierten Protein-kodierenden Gene geschätzt. Für jeden MAG-Contig wurden offene Leserahmen (ORFs) und funktionelle Gene mit Prodigal (v2.6.3, Standardparameter) identifiziert. Transkripte wurden ORFs zugeordnet, die jedem MAG zugeordnet waren, um die mittlere Basisabdeckung jedes ORF abzuschätzen (Bowtie2, Standardparameter, keine Mehrfachzuordnungen zulässig). Um unterschiedliche Sequenzierungstiefen zu normalisieren, haben wir die Häufigkeit geschätzt, indem wir sie durch die Summe der mittleren Basenpaarabdeckung von Housekeeping-Genen in den in jeder Probe identifizierten fokalen MAGs normalisiert haben (Ergänzungsdaten 5). Housekeeping-Gene wurden basierend auf einem vollständigen Sequenzabgleich mit den Hidden-Markov-Modellen (HMMs) von 71 Housekeeping-Einzelkopie-Genen mit einem E-Wert von weniger als 1e-5 als Standard identifiziert102,103. Wenn in einem Metagenom oder Metatranskriptom keine Housekeeping-Gene identifiziert wurden, wurden die Proben aus der weiteren Analyse entfernt. Wir haben auch die Gesamtzahl der mit jedem MAG verbundenen Lesevorgänge für Metagenome und Metatranskriptome geschätzt (Ergänzungsdaten 6) (Ein MAG, der ursprünglich die Vollständigkeits- und Kontaminationskriterien erfüllt hatte, M22, wies durchschnittlich 48 Lesevorgänge auf, die dem Metatranskriptom zugeordnet waren, und wurde dann aus der weiteren Analyse entfernt. ) Für Metatranskriptomanalysen wurden nur ORFs berücksichtigt, die die höchsten 75 % der beobachteten Häufigkeiten aufwiesen und in mindestens 10 % der Proben nachgewiesen wurden.

Die funktionale Annotation von ORFs in fokalen MAGs erfolgte mit dem DRAM-Tool (v1.1.1104, unter Verwendung der Datenbanken UniRef90, MEROPS, PFAM, dbCAN-HMMdb (v8) (alle am 12. Februar 2021 mit DRAM kompiliert) und der von uns erstellten KEGG-Datenbank manuell zur DRAM-Pipeline hinzugefügt (Veröffentlichung 1. Januar 2018). Um Funktionen im Zusammenhang mit dem Terpenstoffwechsel zu erhalten, wurden ORFs ausgewählt, die mit jeder KEGG-Annotation verknüpft waren, die den Ausdruck „Terpen“ enthielt.

MAGs wurden mithilfe von GTDB-tk (v1.4.0,105) einer Taxonomie zugewiesen. Zusammengesetzte fokale MAGs wurden gegen das Chloroplastengenom von Panicum virgatum (NC015990) (BLAST, 2.10.1) ausgerichtet. Wir haben teilweise Übereinstimmungen mit acht Klassen und keine vollständigen Übereinstimmungen festgestellt, was bestätigt, dass es sich bei diesen Klassen nicht um Chloroplastengenome handelte. Darüber hinaus verglichen wir die fokale MAGs-Taxonomie mit unserer zuvor entdeckten 16S-rRNA-Gen-Kernkohorte32. Diese Kohorte besteht aus 61 phylogenetisch unterschiedlichen bakteriellen OTUs (97 % Clustering). Die Taxonomie dieser 61 OTUs wurde mit den 40 MAGs auf Gattungsebene verglichen. Aufgrund der Unterschiede in der Nomenklatur zwischen den GTDB- und SILVA-Datenbanken haben wir Erweiterungen für MAGs entfernt, die als Pseudomonas_E oder Aeromonas_A klassifiziert sind.

Die statistische Analyse wurde in der R-Umgebung für statistische Berechnungen durchgeführt (einschließlich Veröffentlichungen zwischen 2021 und 2023). Zunehmende und abnehmende saisonale Trends in den Funktionsrollen wurden mit linearer Regression bewertet. Paarweise Vergleiche der funktionalen Rollen (die kumulative Summe aller assoziierten ORFs) zwischen der frühen (Mai – Juni) und der späten (Juli – September) Saison wurden mit dem zweiseitigen Kruskal-Wallis-Test basierend auf der Chi-Quadrat-Verteilung nach Rängen durchgeführt , wobei frühe und späte Jahreszeiten anhand der Pflanzenphänologie (Blüte/Seneszenz in der Spätsaison) abgegrenzt wurden. Die Verteilung und Dynamik der MAGs-Transkripte wurden mit Wards Methode zur hierarchischen Clusterbildung unter Verwendung euklidischer Abstände der geschätzten Metatranskriptomhäufigkeiten unter Verwendung von pvclust (Version 2.20)106 verglichen.

Biosynthetische Gencluster (BGC) wurden von antiSMASH (v6.0)107 vorhergesagt und von Big-SCAPE (v1.1.0)108 weiter annotiert. Während in Big-SCAPE nur 8 BGC-Klassen verwendet werden (d. h. PKS I, PKS andere, NRPS, RiPPs, Saccharide, Terpene, PKS/NRPS-Hybride und andere), bietet antiSMASH eine detailliertere Klassifizierung. Wir haben beide Ergebnisse genutzt, um die Diversität und Expression der vorhergesagten BGCs in fokalen MAGs zu untersuchen. Aus jedem vorhergesagten Gencluster haben wir den Ort des biosynthetischen Gens extrahiert (dh gene_kind = „biosynthetic“ und core_position). Um die Transkription mutmaßlicher BGCs innerhalb eines MAG zu bewerten, suchten wir nach Transkripten, die derselben Genomregion der vorhergesagten biosynthetischen Gene zugeordnet sind.

Wir haben Gapseq109 verwendet, um abgeschlossene Stoffwechselwege in unseren fokalen MAGs vorherzusagen. Wir haben die Option „find -p all –b 200“ verwendet, um in der MetaCyc-Datenbank nach Pfaden zu suchen. Wir haben unvollständige Pfade herausgefiltert und die verbleibenden Pfade mithilfe der MetaCyc-Klassifizierung in breitere Kategorien eingeteilt und manuell kuratiert, um uns auf das Verständnis der Pfade zu konzentrieren, die entweder für die Pflanzenumgebung oder für mikrobielle Interaktionen mit Pflanzen relevant sind. Diese Kategorien wurden als potenzielle Beteiligung definiert an: i) Pflanzen (unter Verwendung pflanzlicher Metaboliten/Zellbestandteile), ii) Phytohormonen (bekannte/potenzielle Beteiligung an der Phytohormon-Homöostase), iii) Stress (z. B. Dürre, reaktive Sauerstoffspezies) und iv) allgemein (Wege, die potenzielle pflanzliche Produkte nutzen). Darüber hinaus haben wir auch manuell nach Genen/Wegen gesucht, die von Gapseq übersehen wurden, von denen jedoch bekannt ist, dass sie mit der Anpassung an den pflanzenassoziierten Lebensstil zusammenhängen, einschließlich Sekretionssystemen110,111, Oxidation von Spurengasen (H2 und CO)112,113, Oxalatabbau usw Produktion/Abbau von Phytohormonen. Ähnlich wie bei unserer biosynthetischen Genanalyse wurde die Aktivität vorhergesagter Pfade auf der Grundlage kartierter Transkripte identifizierter Gene geschätzt. Contigs von fokalen MAGS wurden mit neun zuvor berichteten Isoprenoid-Vorläufer-Biosynthesegenen abgeglichen (BLAST v2.7.1 +). Der höchste Treffer jeder Abfrage wurde berücksichtigt und als übereinstimmend akzeptiert, wenn der E-Wert kleiner als 1e-5 war.

Um das Vorhandensein von MAGs in anderen Metagenomen von Rutenhirse und Miscanthus zu bewerten, die auf dem Feld gesammelt wurden, verwendeten wir 55 öffentliche Metagenome von Rutenhirse, Miscanthus und Maisboden (Supplementary Data 7). Metagenomablesungen wurden auf fokale MAGs abgebildet, wobei dieselben Methoden zur Kartierung und Häufigkeitsschätzung verwendet wurden, die oben für die in dieser Studie generierten Metagenome beschrieben wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten rohen und verarbeiteten Metagenom- und Metatranskriptomdaten wurden in der Genome Portal-Datenbank des Joint Genome Institute unter der Vorschlags-ID 503249 [https://genome.jgi.doe.gov/portal/Seadynanfunction/Seadynanfunction.info.html] hinterlegt. . Die in dieser Studie generierten MAGs-Daten wurden im NCBI im Rahmen des Bioprojekts PRJNA800073 hinterlegt. Die Metadaten, einschließlich Metadatenstandards für Metagenome, Metatranskriptome und aus Metagenomen zusammengesetzte Genome, für diese Studie sind in den Zusatzdaten 1–7 enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Kommentierter Code und Links zu Daten und Metadaten sind auf GitHub (https://github.com/ShadeLab/PAPER_Howe_2021_switchgrass_MetaT) und Zenodo (https://zenodo.org/record/10040) verfügbar.

Robertson, GP et al. Beiträge von Zellulose-Biokraftstoffen zu einer nachhaltigen Energiezukunft: Entscheidungen und Ergebnisse. Wissenschaft. (80-.) 356, 1–9 (2017).

Artikel Google Scholar

Ma, L. et al. Der Einfluss von Bestandesalter und Düngung auf das Bodenmiscanthus × giganteus. Phytobiome J. 5, 51–59 (2021).

Artikel Google Scholar

Hestrin, R., Lee, MR, Whitaker, BK & Pett-Ridge, J. Das Mikrobiom der Rutenhirse: eine Übersicht über Struktur, Funktion und taxonomische Verteilung. Phytobiome J. 5, 14–28 (2021).

Artikel Google Scholar

Heaton, EA, Dohleman, FG & Long, SP Erreichen der US-Biokraftstoffziele mit weniger Land: Das Potenzial von Miscanthus. Globus. Chang. Biol. 14, 2000–2014 (2008).

Artikel ADS Google Scholar

Langholtz, M., Stokes, B. & Eaton, L. Milliarden-Tonnen-Bericht 2016: Förderung heimischer Ressourcen für eine florierende Bioökonomie (Zusammenfassung). Ind. Biotechnologie. 12, 282–289 (2016).

Artikel Google Scholar

Roley, SS et al. Assoziative Stickstofffixierung (ANF) über einen Stickstoffeintragsgradienten. PLoS One 13, 1–19 (2018).

Artikel Google Scholar

Toju, H. et al. Kernmikrobiome für nachhaltige Agrarökosysteme. Nat. Pflanzen 4, 247–257 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Busby, PE et al. Forschungsprioritäten zur Nutzung pflanzlicher Mikrobiome in einer nachhaltigen Landwirtschaft. PLoS Biol. 15, 1–14 (2017).

Artikel Google Scholar

Wang, NR & Haney, CH Das genetische Potenzial des Pflanzenmikrobioms nutzen. Biochem. (Lond.) 42, 20–25 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Haskett, TL, Tkacz, A. & Poole, PS Entwicklung von Rhizobakterien für eine nachhaltige Landwirtschaft. ISME J. 15, 949–964 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hacquard, S. et al. Mikrobiota und Wirtsernährung im gesamten Pflanzen- und Tierreich. Cell Host Microbe 17, 603–616 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gopal, M. & Gupta, A. Die Mikrobiomselektion könnte Pflanzenzüchtungsstrategien der nächsten Generation vorantreiben. Vorderseite. Mikrobiol. 7, 1971 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hardoim, PR et al. Die verborgene Welt in Pflanzen: Ökologische und evolutionäre Überlegungen zur Definition der Funktionsweise mikrobieller Endophyten. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. 79, 293–320 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Andrews, JH & Harris, RF Die Ökologie und Biogeographie von Mikroorganismen auf Pflanzenoberflächen. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 145–180 (2000).

Artikel PubMed Google Scholar

Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., van Themaat, EVL & Schulze-Lefert, P. Struktur und Funktionen der bakteriellen Mikrobiota von Pflanzen. Annu. Rev. Plant Biol. 64, 807–838 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Müller, DB, Vogel, C., Bai, Y. & Vorholt, JA Die pflanzliche Mikrobiota: Einblicke und Perspektiven auf Systemebene. Annu. Rev. Genet. 50, 120215–034952 (2016).

Artikel Google Scholar

Kuzyakov, Y. & Razavi, BS Größe und Form der Rhizosphäre: Zeitdynamik und räumliche Stationarität. Bodenbiol. Biochem. 135, 343–360 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Bell, TH et al. Manipulation wilder und gezähmter Phytobiome: Herausforderungen und Chancen. Phytobiome J. 3, 3–21 (2019).

Artikel Google Scholar

Chen, T. et al. Ein pflanzengenetisches Netzwerk zur Vorbeugung von Dysbiose in der Phyllosphäre. Natur 580, 653–657 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vorholt, JA Mikrobielles Leben in der Phyllosphäre. Nat. Rev. Microbiol. 10, 828–840 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Koskella, B. Die Phyllosphäre. Curr. Biol. 30, R1143–R1146 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lindow, SE & Brandl, MT Mikrobiologie der Phyllosphäre. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 69, 1875–1883 ​​(2003).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bringel, F. & Couée, I. Schlüsselrollen von Phyllosphären-Mikroorganismen an der Schnittstelle zwischen Pflanzenfunktion und atmosphärischer Spurengasdynamik. Vorderseite. Mikrobiol. 6, 486 (2015).

Dorokhov, YL, Sheshukova, EV & Komarova, TV Methanol im Pflanzenleben. Vorderseite. Pflanzenwissenschaft. 871, 1–6 (2018).

Google Scholar

Cavicchioli, R. et al. Warnung der Wissenschaftler an die Menschheit: Mikroorganismen und Klimawandel. Nat. Rev. Microbiol. 17, 569–586 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Peñuelas, J. & Terradas, J. Das Blattmikrobiom. Trends Plant Sci. 19, 278–280 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Edwards, J. et al. Struktur, Variation und Aufbau der wurzelassoziierten Mikrobiome von Reis. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA. 112, E911–E920 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhalnina, K. et al. Dynamische Wurzelexsudatchemie und mikrobielle Substratpräferenzen steuern Muster bei der Bildung mikrobieller Gemeinschaften in der Rhizosphäre. Nat. Mikrobiol. 3, 470 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xu, L. et al. Dürre verzögert die Entwicklung des Sorghumwurzel-Mikrobioms und reichert Monodermbakterien an. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 115, E4284–E4293 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shade, A. & Stopnisek, N. Abundanz-Belegungsverteilungen zur Priorisierung der Mikrobiommitgliedschaft im Pflanzenkern. Curr. Meinung. Mikrobiol. 49, 50–58 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Stopnisek, N. & Shade, A. Persistente Mikrobiommitglieder in der Rhizosphäre der Gartenbohne: eine integrierte Analyse von Raum, Zeit und Pflanzengenotyp. ISME J. 15, 2708–2722 (2021).

Grady, KL, Sorensen, JW, Stopnisek, N., Guittar, J. & Shade, A. Aufbau und Saisonalität der Kern-Phyllosphären-Mikrobiota auf mehrjährigen Biokraftstoffpflanzen. Nat. Komm. 10, 4135 (2019).

Singer, E., Bonnette, J., Kenaley, SC, Woyke, T. & Juenger, TE Pflanzenkompartiment und genetische Variation steuern die Mikrobiomzusammensetzung in Rutenhirsewurzeln. Umgebung. Mikrobiol. Rep. 11, 185–195 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lundberg, DS et al. Definition des Kernmikrobioms der Arabidopsis thaliana-Wurzel. Natur 488, 86–90 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bulgarelli, D. et al. Aufdeckung von Struktur- und Aufbauhinweisen für die bakterielle Mikrobiota, die in der Wurzel von Arabidopsis lebt. Natur 488, 91–95 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Bahulikar, RA, Torres-Jerez, I., Worley, E., Craven, K. & Udvardi, MK Vielfalt stickstofffixierender Bakterien im Zusammenhang mit Rutenhirse in der einheimischen Tallgrass-Prärie im Norden Oklahomas. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 80, 5636–5643 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roley, SS, Xue, C., Hamilton, SK, Tiedje, JM & Robertson, GP Isotopennachweis für episodische Stickstofffixierung in Rutenhirse (Panicum virgatum L.). Bodenbiol. Biochem. 129, 90–98 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Bowers, RM et al. Mindestinformationen über ein einzelnes amplifiziertes Genom (MISAG) und ein Metagenom-assembliertes Genom (MIMAG) von Bakterien und Archaeen. Nat. Biotechnologie. 35, 725–731 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoon, SH, Ha, SM, Lim, J., Kwon, S. & Chun, J. Eine groß angelegte Evaluierung von Algorithmen zur Berechnung der durchschnittlichen Nukleotididentität. Antonie van. Leeuwenhoek, Int. J. General Mol. Mikrobiol. 110, 1281–1286 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Julsing, MK, Rijpkema, M., Woerdenbag, HJ, Quax, WJ & Kayser, O. Funktionsanalyse von Genen, die an der Biosynthese von Isopren in Bacillus subtilis beteiligt sind. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 75, 1377–1384 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carlström, CI et al. Synthetische Mikrobiota zeigen vorrangige Effekte und Schlüsselstämme in der Arabidopsis-Phyllosphäre. Nat. Ökologisch. Entwicklung 3, 1445–1454 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Laskowska, E. & Kuczyńska-Wiśnik, D. Neue Einblicke in die Mechanismen, die Bakterien während der Austrocknung schützen. Curr. Genet. 66, 313–318 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zou, H. et al. Der Stoffwechsel und die biotechnologische Anwendung von Betain in Mikroorganismen. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 100, 3865–3876 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rastogi, G., Coaker, GL & Leveau, JHJ Neue Einblicke in die Struktur und Funktion der Phyllosphären-Mikrobiota durch molekulare Hochdurchsatzansätze. FEMS Mikrobiol. Lette. 348, 1–10 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Urrejola, C. et al. Genomische Merkmale für Austrocknungstoleranz und Zuckerbiosynthese im extremophilen Gloeocapsopsis sp. UTEX B3054. Vorderseite. Mikrobiol. 10, 1–11 (2019).

Artikel Google Scholar

Lacerda-Júnior, GV et al. Landnutzung und saisonale Auswirkungen auf das Bodenmikrobiom eines brasilianischen Trockenwaldes. Vorderseite. Mikrobiol. 10, 1–14 (2019).

Artikel Google Scholar

Dai, J. et al. Aufklärung der Anpassung von Pontibacter korlensis an Strahlung und Unfruchtbarkeit in der Wüste durch vollständige Genom- und vergleichende transkriptomische Analyse. Wissenschaft. Rep. 5, 1–9 (2015).

Artikel Google Scholar

Harty, CE et al. Ethanol stimuliert die Trehaloseproduktion über einen SpoT-DksA-AlgU-abhängigen Weg in Pseudomonas aeruginosa. J. Bakteriol. 201, 1–21 (2019).

Kimmerer, TW & MacDonald, RC Acetaldehyd- und Ethanol-Biosynthese in Pflanzenblättern. Pflanzenphysiologie. 84, 1204–1209 (1987).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferner, E., Rennenberg, H. & Kreuzwieser, J. Einfluss von Überschwemmungen auf den C-Stoffwechsel von überschwemmungstoleranten (Quercus robur) und nicht toleranten (Fagus sylvatica) Baumarten. Baumphysiol. 32, 135–145 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kimmerer, TW & Kozlowski, TT Ethylen-, Ethan-, Acetaldehyd- und Ethanolproduktion durch Pflanzen unter Stress. Pflanzenphysiologie. 69, 840–847 (1982).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Y. et al. Bewertung der Trockenheitstoleranz von 49 Rutenhirse-Genotypen (Panicum virgatum) anhand physiologischer und morphologischer Parameter. Biotechnologie. Biokraftstoffe 8, 1–18 (2015).

Artikel Google Scholar

Wingler, A. et al. Trehalose-6-phosphat ist für den Beginn der Blattalterung erforderlich, die mit einer hohen Kohlenstoffverfügbarkeit einhergeht. Pflanzenphysiologie. 158, 1241–1251 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gottschlich, L., Geiser, P., Bortfeld-Miller, M., Field, CM & Vorholt, JA Komplexe allgemeine Stressreaktionsregulation in Sphingomonas melonis Fr1 durch Transkriptionsanalysen aufgedeckt. Wissenschaft. Rep. 9, 1–13 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, C., Li, S., McKeever, DR & Beattie, GA Die weit verbreitete pflanzenbesiedelnde Bakterienart Pseudomonas syringae erkennt und nutzt einen extrazellulären Cholinpool in Wirten. Plant J. 75, 891–902 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Valenzuela-Soto, EM & Figueroa-Soto, CG Biosynthese und Abbau von Glycinbetain und sein Potenzial zur Steuerung von Pflanzenwachstum und -entwicklung. in Osmoprotectant-Mediated Abiotic Stress Tolerance in Plants (Hrsg. Anwar Hossain, M., Kumar, V., Burritt, DJ, Fujita, M. & Makela, PSA) 241–256 (Springer, 2019). https://doi.org/10.1007/978-3-030-27423-8_5.

Kerchev, P., De Smet, B., Waszczak, C., Messens, J. & Van Breusegem, F. Redox-Strategien zur Pflanzenverbesserung. Antioxid. Redox Signal 23, 1186–1205 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Considine, MJ & Foyer, CH Redoxregulation der Pflanzenentwicklung. Antioxid. Redox-Signal. 21, 1305–1326 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spaepen, S., Vanderleyden, J. & Remans, R. Indol-3-Essigsäure in der mikrobiellen und mikrobiellen Pflanzensignalisierung. FEMS Mikrobiol. Rev. 31, 425–448 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Egamberdieva, D., Wirth, SJ, Alqarawi, AA, Abd-Allah, EF & Hashem, A. Phytohormone und nützliche Mikroben: Wesentliche Komponenten für Pflanzen, um Stress und Fitness auszugleichen. Vorderseite. Mikrobiol. 8, 1–14 (2017).

Artikel Google Scholar

Lajoie, G., Maglione, R. & Kembel, SW Adaptives Matching zwischen Phyllosphärenbakterien und ihren Baumwirten in einem neotropischen Wald. Mikrobiom 8, 1–10 (2020).

Artikel Google Scholar

McGenity, TJ, Crombie, AT & Murrell, JC Mikrobieller Kreislauf von Isopren, der am häufigsten produzierten biologischen flüchtigen organischen Verbindung auf der Erde. ISME J. 12, 931–941 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharkey, TD, Wiberley, AE & Donohue, AR Isoprenemissionen aus Pflanzen: Warum und wie. Ann. Bot. 101, 5–18 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zuo, Z. et al. Isopren fungiert als Signalmolekül in Gennetzwerken, die für Stressreaktionen und Pflanzenwachstum wichtig sind. Pflanzenphysiologie. 180, 124–152 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharkey, TD & Yeh, S. Isoprenemission aus Pflanzen. Pflanzenmol. Biol. 52, 407–436 (2001).

CAS Google Scholar

Sharkey, TD, Loreto, F. & Delwiche, C. Hohe Kohlendioxid- und Sonnen-/Schatteneffekte auf die Isoprenemission von Eichen- und Espenblättern. Pflanze, Zellumgebung. 14, 333–338 (1991).

Artikel CAS Google Scholar

Eller, ASD et al. Emissionen flüchtiger organischer Verbindungen aus Rutenhirse-Sorten, die als Biokraftstoffpflanzen verwendet werden. Atmosphäre. Umgebung. 45, 3333–3337 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Morrison, EC, Drewer, J. & Heal, MR Ein Vergleich der Isopren- und Monoterpenemissionsraten der mehrjährigen Bioenergiepflanzen Kurzumtriebsweide und Miscanthus und der einjährigen Ackerkulturen Weizen und Raps. GCB Bioenergy 8, 211–225 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Sivy, TL, Shirk, MC & Fall, R. Die Isopren-Synthase-Aktivität verläuft parallel zu den Schwankungen der Isopren-Freisetzung während des Wachstums von Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Komm. 294, 71–75 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Crombie, AT et al. Die Phyllosphäre der Pappel beherbergt unterschiedliche Isopren abbauende Bakterien. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA. 115, 13081–13086 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

El Khawand, M. et al. Isolierung von Isopren abbauenden Bakterien aus Böden, Entwicklung von IsoA-Gensonden und Identifizierung der aktiven Isopren abbauenden Bodengemeinschaft mittels DNA-stabiler Isotopensondierung. Umgebung. Mikrobiol. 18, 2743–2753 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nowicka, B. & Kruk, J. Vorkommen, Biosynthese und Funktion von Isoprenoidchinonen. Biochim. Biophys. Acta - Bioenerg. 1797, 1587–1605 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Kałużna, M. et al. Pseudomonas cerasi sp. Nov. (non Griffin, 1911) isoliert aus erkranktem Kirschgewebe. Syst. Appl. Mikrobiol. 39, 370–377 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

El-Tarabily, KA, Nassar, AH, Hardy, GESJ & Sivasithamparam, K. Förderung des Pflanzenwachstums und biologische Kontrolle von Pythium aphanidermatum, einem Krankheitserreger der Gurke, durch endophytische Actinomyceten. J. Appl. Microbiol 106, 13–26 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Javed, Z., Tripathi, GD, Mishra, M. & Dashora, K. Actinomycetes – die mikrobielle Maschinerie für den organischen Kreislauf, das Pflanzenwachstum und eine nachhaltige Bodengesundheit. Biokatalysator. Landwirtschaft. Biotechnologie. 31, 101893 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Anwar, S., Ali, B. & Sajid, I. Screening rhizosphärischer Actinomyceten auf verschiedene In-vitro- und In-vivo-Pflanzenwachstumsfördernde (PGP) Merkmale und auf agroaktive Verbindungen. Vorderseite. Mikrobiol. 7, 1–11 (2016).

Artikel Google Scholar

Bao, L. et al. Überlappung der Mikrobengemeinschaft zwischen der Phyllosphäre und der Rhizosphäre von drei Pflanzen von der Insel Yongxing im Südchinesischen Meer. Mikrobiologieopen 9, 1–18 (2020).

Artikel Google Scholar

Remus-Emsermann, MNP & Schlechter, RO Phyllosphären-Mikrobiologie: an der Schnittstelle zwischen mikrobiellen Individuen und dem Pflanzenwirt. N. Phytol. 218, 1327–1333 (2018).

Artikel Google Scholar

Beilsmith, K. et al. Genomweite Assoziationsstudien zum Phyllosphären-Mikrobiom: Berücksichtigung der Komplexität der Wirt-Mikroben-Interaktionen. Pflanze J. 97, 164–181 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Levy, A., Conway, JM, Dangl, JL & Woyke, T. Aufklärung bakterieller Genfunktionen im Pflanzenmikrobiom. Cell Host Microbe 24, 475–485 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Trivedi, P., Leach, JE, Tringe, SG, Sa, T. & Singh, BK Pflanze-Mikrobiom-Interaktionen: von der Gemeindeversammlung bis zur Pflanzengesundheit. Nat. Rev. Microbiol. 18, 607–621 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Choi, H. et al. Identifizierung von Viren und Viroiden, die Tomaten- und Paprikapflanzen in Vietnam infizieren, durch Metatranskriptomik. Int. J. Mol. Wissenschaft. 21, 1–16 (2020).

Artikel ADS Google Scholar

Marzano, SYL & Domier, LL Neuartige Mykoviren, die bei einer metatranskriptomischen Untersuchung der Phytobiome der Sojabohnen-Phyllosphäre entdeckt wurden. Virus Res 213, 332–342 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chao S, et al. Metatranskriptomische Sequenzierung deutet auf das Vorhandensein neuartiger RNA-Viren in Reis hin, die von der Braunen Zikaden übertragen werden. Viren. 13, 2464 (2021).

Delmotte, N. et al. Community-Proteogenomik liefert Einblicke in die Physiologie von Phyllosphärenbakterien. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 106, 16428–16433 (2009).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suzuki, Y., Makino, A. & Mae, T. Eine effiziente Methode zur Extraktion von RNA aus Reisblättern unterschiedlichen Alters unter Verwendung von Benzylchlorid. J. Exp. Bot. 52, 1575–1579 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Caporaso, JG et al. Globale Muster der 16S-rRNA-Diversität in einer Tiefe von Millionen von Sequenzen pro Probe. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 108, 4516–4522 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: ein flexibler Trimmer für Illumina-Sequenzdaten. Bioinformatik 30, 2114–2120 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Langmead, B. & Salzberg, SL Schnelle Lücken-Lese-Ausrichtung mit Bowtie 2. Nat. Methoden 9, 357–359 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. et al. Das Sequenzausrichtungs-/Kartenformat und SAMtools. Bioinformatik 25, 2078–2079 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Quinlan, AR & Hall, IM BEDTools: eine flexible Suite von Dienstprogrammen zum Vergleich genomischer Merkmale. Bioinformatik 26, 841–842 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Druzhinina, IS et al. Massiver lateraler Transfer von Genen, die für Enzyme, die Pflanzenzellwände abbauen, kodieren, von seinen pflanzenassoziierten Wirten auf den mykoparasitären Pilz Trichoderma. PLoS Genet. 14, e1007322 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Haridas, S. et al. 101 Dothideomycetes-Genome: Ein Testfall zur Vorhersage von Lebensstilen und der Entstehung von Krankheitserregern. Zucht. Mykol. 96, 141–153 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gostinčar, C. et al. Genomsequenzierung von vier Aureobasidium pullulans-Sorten: Biotechnologisches Potenzial, Stresstoleranz und Beschreibung neuer Arten. BMC Genomics 15, 549 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gill, US et al. Entwurf einer Genomsequenzressource des Rutenhirse-Rosterregers, Puccinia novopanici-Isolat ard-01. Phytopathology 109, 1513–1515 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bowsher, AW, Benucci, GMN, Bonito, G. & Shade, A. Saisonale Dynamik von Kernpilzen in der Rutenhirse-Phyllosphäre und gleichzeitiges Vorkommen mit Blattbakterien. Phytobiome J. 5, 60–68 (2021).

Li, D., Liu, CM, Luo, R., Sadakane, K. & Lam, TW MEGAHIT: Eine ultraschnelle Single-Node-Lösung für die Zusammenstellung großer und komplexer Metagenomics mithilfe eines prägnanten de Bruijn-Graphen. Bioinformatik 31, 1674–1676 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kang, DD et al. MetaBAT 2: Ein adaptiver Binning-Algorithmus für eine robuste und effiziente Genomrekonstruktion aus Metagenom-Assemblys. PeerJ 2019, 1–13 (2019).

Google Scholar

Nayfach, S., Shi, ZJ, Seshadri, R., Pollard, KS & Kyrpides, NC Neue Erkenntnisse aus unkultivierten Genomen des globalen menschlichen Darmmikrobioms. Natur 568, 505–510 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parks, DH, Imelfort, M., Skennerton, CT, Hugenholtz, P. & Tyson, GW CheckM: Bewertung der Qualität mikrobieller Genome, die aus Isolaten, Einzelzellen und Metagenomen gewonnen wurden. Genomres. 25, 1043–1055 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Swan, BK et al. Vorherrschende Genom-Straffung und Breitendivergenz planktonischer Bakterien im Oberflächenozean. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA. 110, 11463–11468 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eren, AM et al. Anvi'o: eine fortschrittliche Analyse- und Visualisierungsplattform für Omics-Daten. PeerJ. 2015, 1–29 (2015).

Google Scholar

Lee, MD GToTree: ein benutzerfreundlicher Workflow für die Phylogenomik. Bioinformatik 35, 4162–4164 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shaffer, M. et al. DRAM zum Destillieren des mikrobiellen Stoffwechsels, um die Kuration der Mikrobiomfunktion zu automatisieren. Nukleinsäuren Res. 48, 8883–8900 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parks, DH et al. Eine standardisierte bakterielle Taxonomie basierend auf der Genom-Phylogenie überarbeitet den Lebensbaum grundlegend. Nat. Biotechnologie. 36, 996 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Suzuki, R. & Shimodaira, H. Pvclust: ein R-Paket zur Bewertung der Unsicherheit bei hierarchischem Clustering. Bioinformatik 22, 1540–1542 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Blin, K. et al. AntiSMASH 6.0: Verbesserung der Clustererkennungs- und Vergleichsfunktionen. Nukleinsäuren Res. 49, W29–W35 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Navarro-Muñoz, JC et al. Ein Computerrahmen zur Erforschung der biosynthetischen Vielfalt im großen Maßstab. Nat. Chem. Biol. 16, 60–68 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Zimmermann, J., Kaleta, C. & Waschina, S. Gapseq: fundierte Vorhersage bakterieller Stoffwechselwege und Rekonstruktion genauer Stoffwechselmodelle. Genombiol. 22, 1–35 (2021).

Artikel Google Scholar

Tseng, TT, Tyler, BM & Setubal, JC Proteinsekretionssysteme in Bakterien-Wirt-Assoziationen und ihre Beschreibung in der Gene Ontology. BMC Microbiol 9, 1–9 (2009).

Artikel Google Scholar

Lucke, M., Correa, MG & Levy, A. Die Rolle von Sekretionssystemen, Effektoren und Sekundärmetaboliten nützlicher Rhizobien bei Interaktionen mit Pflanzen und Mikroben. Vorderseite. Pflanzenwissenschaft. 11, 589416 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Palmer, JL, Hilton, S., Picot, E., Bending, GD & Schäfer, H. Baumphyllosphären sind ein Lebensraum für verschiedene Populationen CO-oxidierender Bakterien. Umgebung. Mikrobiol. 23, 6309–6327 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bay, SK et al. Spurengasoxidationsmittel sind weit verbreitete und aktive Mitglieder mikrobieller Gemeinschaften im Boden. Nat. Mikrobiol. 6, 246–256 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Diese Forschung wurde vom Great Lakes Bioenergy Research Center, dem US-Energieministerium, dem Office of Science, dem Office of Biological and Environmental Research (Auszeichnungen DE-SC0018409 und DE-FC02-07ER64494) und der National Science Foundation Long-Term unterstützt Ökologisches Forschungsprogramm (DEB 1637653 und 1832042) an der Kellogg Biological Station, AgBioResearch der Michigan State University und vom DOE Center for Advanced Bioenergy and Bioproducts Innovation (US-Energieministerium, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research unter der Auszeichnungsnummer). DE-SC0018420). Diese Arbeit wurde teilweise auch von der Michigan State University durch Rechenressourcen des Institute for Cyber-Enabled Research und teilweise vom University of Wisconsin-Madison Wisconsin Energy Institute mit Unterstützung von GLBRC Information Services unterstützt. Die Arbeit [Vorschlag:10.46936/10.25585/60000818], durchgeführt vom Joint Genome Institute des US-Energieministeriums [https://ror.org/04xm1d337], einer Benutzereinrichtung des DOE Office of Science, wird vom Office of Science der unterstützt US-Energieministerium, betrieben unter der Vertragsnummer DE-AC02-05CH11231. AS dankt dem USDA National Institute of Food and Agriculture und der Michigan State University AgBioResearch für die Unterstützung. NS dankt dem Plant Resilience Institute der Michigan State University für seine Unterstützung.

Ashley Shade

Aktuelle Adresse: Univ Lyon, CNRS, INSA Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Ecole Centrale de Lyon, Ampère, UMR5005, 69134, Ecully cedex, Frankreich

Abteilung für Agrar- und Biosystemtechnik, Iowa State University, Ames, IA, 50011, USA

Adina Howe, Shane K. Dooley und Fan Yang

Abteilung für Bioinformatik und Computational Biology, Iowa State University, Ames, IA, 50011, USA

Adina Howe und Shane K. Dooley

Zentrum für fortschrittliche Bioenergie- und Bioproduktinnovation, Ames, IA, 50011, USA

Adina Howe

Das Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University, East Lansing, MI, 48824, USA

Nejc Stopnisek, Keara L. Grady & Ashley Shade

Abteilung für Mikrobiologie und Molekulargenetik, Michigan State University, East Lansing, MI, 48824, USA

Nejc Stopnisek, Keara L. Grady & Ashley Shade

Das Plant Resilience Institute, Michigan State University, East Lansing, MI, 48824, USA

Nejc Stopnisek & Ashley Shade

Abteilung für Pflanzen-, Boden- und Mikrobenwissenschaften, Michigan State University, East Lansing, MI, 48824, USA

Ashley Shade

Programm für Ökologie, Evolution und Verhalten, Michigan State University, East Lansing, MI, 48824, USA

Ashley Shade

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KLG und AS konzipierten und gestalteten Experimente; NS, KLG und AS führten die Experimente durch; AH, NS, SKD, FY und AS analysierten die Daten; AH, NS, SKD, FY, KLG und AS haben Materialien/Analysetools beigesteuert; und AH, NS, SKD, FY, KLG und AS haben den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Ashley Shade.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Howe, A., Stopnisek, N., Dooley, SK et al. Saisonale Aktivitäten des Phyllosphären-Mikrobioms mehrjähriger Kulturpflanzen. Nat Commun 14, 1039 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36515-y

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Eingegangen: 08. November 2022

Angenommen: 03. Februar 2023

Veröffentlicht: 23. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36515-y

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